Работал в Московском государственном институте экспериментальной психологии (1924—1928), в Государственном институте научной педагогики (ГИНП) при ЛГПИ и в ЛГПИ им. А. И. Герцена (оба в 1927—1934), Академии Коммунистического воспитания (АКВ) (1929—1931), 2-м МГУ (1927—1930), а после реорганизации 2-го МГУ — в МГПИ им. А. С. Бубнова (1930—1934), а также в основанном им Экспериментальном дефектологическом институте (1929—1934); также читал курсы лекций в ряде учебных заведений и исследовательских организаций Москвы, Ленинграда, Ташкента и Харькова, например, в Средне-азиатском государственном университете (САГУ) (в 1929 году).
Выготский в широком объеме занимался педагогикой, консультационной и исследовательской деятельностью. Он был членом многих редколлегий, и сам много писал. Несмотря на материалистическую форму своей теории, Выготский придерживался эмпирического эволюционистского направления в изучении культурных различий мышления, создав подход к психологии. Исследуя речевое мышление, Выготский по-новому решает проблему локализации высших психических функций как структурных единиц деятельности мозга. Изучая развитие и распад высших психических функций на материале детской психологии, дефектологии и психиатрии, Выготский приходит к выводу, что структура сознания — это динамическая смысловая система находящихся в единстве аффективных волевых и интеллектуальных процессов.
В 1928-32 Выготский вместе с коллегами Лурией и Леонтьевым участвовал в экспериментальных исследованиях в Академии коммунистического образования. Выготский возглавлял психологическую лабораторию, а Лурия – весь факультет. Наибольшую известность принесла Выготскому созданная им психологическая теория, приобретшая широкую известность под названием Культуро-историческая концепция развития высших психических функций, теоретический и эмпирический потенциал которой не исчерпан до сих пор. Сутью этой концепции является синтез учения о природе и учения о культуре. Теория представляет альтернативу существовавшим поведенческим теориям, и прежде всего бихевиоризму. По мнению самого автора, изучение основных закономерностей развития культуры может дать представление о законах формирования личности. Лев Семенович рассматривал эту проблему в свете детской психологии. Духовное развитие ребенка было поставлено в определенную зависимость от организованного воздействия на него взрослых. У Льва Семеновича много работ посвящено изучению психического развития и закономерностей становления личности в детском возрасте, проблемам учения и обучения детей в школе. Именно Выготскому принадлежит самая выдающаяся роль в становлении науки дефектологии. Он создал в Москве лабораторию психологии аномального детства, которая стала впоследствии составной частью Экспериментального дефектологического института. Основной упор при изучении психологических особенностей аномальных детей Выготский делал на умственно отсталых и слепоглухонемых.
В работах Выготского подробно рассмотрена проблема соотношения роли созревания и обучения в развитии высших психических функций ребёнка. Им был сформулирован важнейший принцип, согласно которому сохранность и своевременное созревание структур мозга есть необходимое, но недостаточное условие развития высших психических функций. Главным же источником для этого развития является изменяющаяся социальная среда, для описания которой Выготским введён термин социальная ситуация развития, определяемая как «своеобразное, специфическое для данно¬го возраста, исключительное, единственное и неповторимое отношение между ребенком и окружающей его действительностью, прежде всего социаль¬ной». Именно это отношение определяет ход развития психики ребёнка на определённом возрастном этапе.
Существенным вкладом в педагогическую психологию является введённое Выготским понятие зона ближайшего развития. Зона ближайшего развития — «область не созревших, но созревающих процессов», объемлющая задачи, с которыми ребёнок на данном уровне развития не может справиться сам, но которые способен решить с помощью взрослого; это уровень, достигаемый ребёнком пока лишь в ходе совместной деятельности с взрослым.
На последнем этапе своей научной деятельности Выготского заинтересовали проблемы мышления и речи и им была написана научная работа Мышление и речь. В этом фундаментальном научном труде основной является мысль о неразрывной связи, существующей между мышлением и речью. Выготский сначала высказал предположение, которое вскоре сам же и подтвердил, что от формирования и развития речи зависит уровень развития мышления. Он выявил взаимообусловленность двух этих процессов.
При жизни Льва Семеновича его работы не допускались к публикации в СССР. С начала 1930-х гг. на него началась настоящая травля, власти обвиняли его в идеологических извращениях. 11 июня 1934 г. после продолжительной болезни, в возрасте 37 лет Лев Семенович Выготский умер.