По окончании Крымской кампании С. П. Боткин вернулся в Москву. Он пришёл к убеждению, что ему необходимо продолжать своё медицинское образование, и в начале 1856 г. выехал за границу. В Германии он работал в патологическом институте Р. Вирхова, основателя клеточной патологии, и в то же время занимался физиологической и патологической химией.
Осенью 1800 г. Боткин вернулся в Петербург; где успешно защитил диссертацию на тему «О всасывании жира в кишках» и в том же году был назначен адъюнктом академической (факультетской) терапевтической клиники Медико-хирургической академии. Боткин стал ординарным профессором этой клиники. С первого же года вступления на кафедру Сергей Петрович создал при клинике лабораторию, которой вначале заведовал сам, а с 1878 г. в течение десяти лет управление лабораторией осуществлял И. П. Павлов. Здесь, помимо клинических анализов, изучалось фармакологическое действие новых лекарственных средств, и производились опыты над животными с целью искусственного воспроизведения патологических процессов и выяснения их патогенеза.
Боткин внес в клинику физиологические и лабораторно-экспериментальные методы исследования, рассматривал эксперимент в клинике как средство, раскрывающее механизм болезней. Клинико-теоретические взгляды Боткина наиболее полно изложены в выпусках курса клиники внутренних болезней и клинических лекциях.
Внимание Боткина постоянно привлекали "больные" вопросы столичных больниц. Несмотря на перегруженность работой по клинике, по руководству диссертационными работами многочисленных учеников, по Обществу русских врачей в Петербурге в качестве его председателя, по должности лейб-медика, он был бессменным председателем думской комиссии охраны общественного здоровья, улучшения санитарного состояния Петербурга и больнично-амбулаторной помощи в нём.
Создал новое направление в медицине, названное И.П. Павловым нервизмом. Современная медицина обязана Боткину тем, что он одним из первых подметил, какую важную роль в организме человека играет центральная нервная система. Он понял, что болезнь не поражает отдельный участок тела или орган, а влияет через нервную систему на весь организм. Только постигнув это, врач может правильно лечить больного. Эту мысль Боткин развил в своих трудах. Его научные взгляды были подхвачены большинством русских передовых врачей, поэтому мы говорим о Боткине как о создателе отечественной научной медицинской школы. Наука обязана Боткину и другими крупными открытиями. На заре развития микробиологии он утверждал, что заболевание, известное как желтуха, вызывается микроорганизмами. Это предвидение оправдалось: ученые нашли возбудителя инфекционной желтухи, которая называется теперь болезнью Боткина. Боткин сделал много замечательных предсказаний. В своих лекциях он выразил, например, уверенность, что в головном мозге человека будут найдены особые центры, которые управляют кроветворением, отделением пота, регуляцией тепла и т. д. Сейчас существование таких центров доказано. Боткин первым высказал мысль о специфичности строения белка в различных органах; установил инфекционный характер заболевания - вирусного гепатита, известного ранее под названием "катаральная желтуха"; разработал диагностику и клинику блуждающей почки.
Боткин издавал "Архив клиники внутренних болезней профессора С.П. Боткина" (1869-1889) и "Еженедельную клиническую газету" (1881-1889). Выступал активным борцом за равноправие женщин. В 1872 году участвовал в организации Женских врачебных курсов. В 1861 году открыл при своей клинике первую в истории клинического лечения больных бесплатную амбулаторию. В 1878 году был избран председателем Общества русских врачей в память Н. И. Пирогова и оставался на этом посту до конца жизни. Впервые в России добился постройки бесплатной больницы, открытой в 1880 году (Александровская барачная больница, ныне Инфекционная больница им. С.П. Боткина) в Петербурге. В 1881 г. Боткин был избран гласным Городской думы, заместителем председателя Комиссии общественного здоровья, создатель системы думских врачей и школьного санитарного надзора. С 1886 попечитель всех городских больниц и богаделен Санкт-Петербурга. Ввёл институт санитарных врачей, разработал мероприятия по улучшению санитарного состояния и снижению смертности в России (1886). Является создателем научной школы терапевтов: из 106 его учеников 85 стали докторами наук, 45 возглавили клинические кафедры в Санкт-Петербурге и других городах.
Сергей Петрович Боткин умер 24 декабря 1889 г.
Печатные труды Боткина: "Застой, образовавшийся в кровеносных сосудах брыжжейки лягушки, от действия средних солей" ("Военно-медиц. журн." 1853); "Количественное определение белка и сахара в моче посредством поляризационного аппарата" ("Московск. медиц. газ.", 1858, №13); тоже "Определение молочного сахара" ("Моск. мед. газ.", 1882, №19); "О всасывании жира в кишках"("Воен. мед. жур.", 1860); "О физиологическом действии сернокислого атропина" ("Мед. Вестн.", 1861 г., №29); "Ueber die Wirkung der Salze auf die circulirenden rothen Blutkorperchen"("Архив Вирхова", XV, 173, 1858); "Zur Frage von dem Stofwechsel der Fette in thierischen Organismen" ("Архив Вирхова", XV, 380);" "Untersuchungen uber die Diffusion organischer Stoffe: 1) Diffusionsverhaltnisse der rothen Blutkorperchen ausserhalb des Organismus" ("Архив Вирхова", XX, 26); 2) "Ueber die Eigenthumlichkeiten des Gallenpigment hinsichtlich der Diffusion" ("Архив Вирхова", XX, 37) и 3) "Zur Frage des endosmotischen Verhalten des Eiweis" (там же, XX, 39); "Случай тромбоза воротной вены" ("Мед. вестн.", 1863 г. 37 и 38); "Предварительное сообщение об эпидемии возвратной горячки в Петербурге" ("Мед. Вест.", 1864, №46); "К этиологии возвратной горячки в Петербурге" ("Мед. В.", 1865, №1); "Курс клиники внутренних болезней" (вып. 1 - 1867 г.; вып. 2-й - 1868 г. и вып. 3-й - 1875 г.); "Предварительное сообщение по поводу эпидемии холеры" (приложение к № 3 "Эпидемиологич. листка" за 1871 г.); "Архив клиники внутренних болезней" (7 том. с 1869 по 1881 г.); "Клинические лекции", 3 выпуска; с 1881 г. издавалась под его редакцией "Еженедельная клиническая газета".