Получив диплом, ещё несколько лет учился за границей. В возрасте 26 лет Пирогов получил звание профессора и возглавил хирургическую клинику в Дерптском университете. В 1832 г. Н. И. Пирогов защитил докторскую диссертацию «Является ли перевязка брюшной аорты при аневризме паховой области легко выполнимым и безопасным вмешательством», написанную на латинском языке. Этой работой было положено начало экспериментальной хирургии, поставленной на службу клинике, открыта новая страница хирургии — учение о коллатеральном кровообращении, блестяще развитое в дальнейшем русскими учеными.
Через пять лет (в 1841 г.) Пирогов был приглашен в Петербургскую медико-хирургическую академию, где и пробыл почти 15 лет (1841-1856 гг.), до своей отставки. Здесь он создал первый в России анатомический институт. Одновременно Пирогов руководил организованной им клиникой госпитальной хирургии. Поскольку в обязанности Пирогова входило обучение военных хирургов, он занялся изучением распространённых в те времена хирургических методов. Многие из них были им в корне переработаны; кроме того, Пирогов разработал ряд совершенно новых приёмов, благодаря чему ему удавалось чаще, чем другим хирургам, избегать ампутации конечностей.
В поисках действенного метода обучения, Пирогов решил применить анатомические исследования на замороженных трупах. Сам Пирогов это называл «ледяной анатомией». Так родилась новая медицинская дисциплина — топографическая анатомия. Спустя несколько лет такого изучения анатомии, Пирогов издал первый анатомический атлас под заглавием «Топографическая анатомия, иллюстрированная разрезами, проведёнными через замороженное тело человека в трёх направлениях», ставший незаменимым руководством для врачей-хирургов. С этого момента хирурги получили возможность оперировать, нанося минимальные травмы больному. Этот атлас и предложенная Пироговым методика стали основой всего последующего развития оперативной хирургии.
Некоторое время Николай Иванович возглавлял Инструментальный завод, где совершенствовал хирургические инструменты и разрабатывал новые. 16 октября 1846 г. произошло первое испытание эфирного наркоза, который стал быстро завоевывать мир.
Вскоре Пирогов принял участие в военных действиях на Кавказе, где в полевых условиях проверял разработанные им методики. Впервые в истории медицины он начал оперировать раненых с эфирным обезболиванием, проведя около 10 000 операций. В 1847 году Пирогов уехал на Кавказ в действующую армию, так как хотел проверить в полевых условиях разработанные им операционные методы. На Кавказе он впервые применил перевязку бинтами, пропитанными крахмалом. Крахмальная перевязка оказалась удобнее и прочнее, чем применявшиеся раньше лубки. Здесь же, в ауле Салты, Пирогов впервые в истории медицины начал оперировать раненых с эфирным обезболиванием в полевых условиях. Всего великий хирург провёл около 10 000 операций под эфирным наркозом. При обороне Севастополя Пирогов проявил себя и великолепным организатором, заложив основы военно-полевой медицины. Он внедрил сортировку раненых по пяти категориям, позволявшую упорядочить оказание помощи: одним операцию делали прямо в боевых условиях, других эвакуировали после оказания помощи и т.д. По его инициативе в армии появились сестры милосердия.
Несмотря на героическую оборону, Севастополь был взят осаждающими, и Крымская война была проиграна Россией. Отсталость царской России, продажность чиновничества, бездарность верховного командования, осуществляемого князем Меньшиковым, была основной причиной поражения. Вернувшись в Петербург, Пирогов на приёме у Александра II доложил об этом царю. Царь не захотел прислушаться к Пирогову, и с этого момента Николай Иванович впал в немилость и был «сослан» в Одессу на должность попечителя Одесского и Киевского учебных округов. Пирогов попытался реформировать сложившуюся систему школьного образования, его действия привели к конфликту с властями, и учёному пришлось оставить свой пост. Пирогов уединился в родовом имении Вишня недалеко от Винницы, где организовал бесплатную больницу Умер Николай Иванович 27 октября 1881 г. Незадолго до смерти ученый сделал еще одно открытие – предложил совершенно новый способ бальзамирования умерших. В музее села Вишни до сих пор хранятся забальзамированные этим способом останки ученого.