Закончив в степени кандидата наук в 1881 году, Гамалея решает продолжить свое медицинское образование в самой престижной по тем временам Военно-медицинской академии в Петербурге. В 1883 году, Николай Гамалея заканчивает Военно-медицинскую академию, отказывается от предложения остаться в Петербурге и возвращается в Одессу, где начинает работать ординатором в клинике нервных болезней, а также, устраивает дома микробиологическую лабораторию. В 1885 г. Пастером была сделана успешная прививка против бешенства, и общество врачей по рекомендации Мечникова командирует Гамалея в Париж для ознакомления с методом приготовления вакцины. 11 июня 1886 г. в Одессе открылась первая в России и вторая в мире станция для прививок против бешенства. В домашней лаборатории в Одессе Гамалей также ведет научно-исследовательские работы по изучению чумы, холеры, туберкулеза, сибирской язвы. Но главной задачей пока были прививки от бешенства, благодаря чему, ученый собрал огромный практический материал, позволивший ему усовершенствовать вакцины, описать паралитическую форму бешенства, не известную прежде.
Большие заслуги принадлежат Гамалея в изучении причин распространения холеры и чумы и радикальной борьбе с ними. Что касается холеры, он установил водный путь заражения и указал способ предохранения населения России через упорядочение водоснабжения в нескольких узловых пунктах на пути ее распространения из Средней Азии. Осуществление этих мероприятий остановило последующие эпидемии. Заслуги ученый имеет в изучении причин распространения холеры и чумы и радикальной борьбе с ними. Николай Федорович открыл у птиц вибрион, совершенно схожий, как он доказал в дальнейшем, с холерным, и назвал его вибрионом Мечникова. В 1902 г. во время эпидемии чумы в Одессе Гамалея доказал, что черные крысы, которых он назвал пароходными, распространяют чуму в портовых городах. Он предложил принять все меры к истреблению грызунов.
Он вел борьбу с бешенством, сибирской лавой, чумой, холерой, оспой, туберкулезом, гриппом. Каждую болезнь он подробно изучал и находил новые способы преодоления ее. H. Ф. Гамалея разработал оригинальную теорию происхождения раковых заболеваний и первый выдвинул идею вирусного происхождения рака.
Исключительно велик вклад Гамалеи в практическую борьбу с оспой и тифом. Николай Федорович разработал интенсивные методы получения оспенного детрита. Им были проведены работы по предохранительным прививкам против сыпного тифа и туберкулеза. Обнаружив, что в распространении паразитарных тифов участвуют насекомые, он организовал борьбу со вшивостью в ночлежных домах Петербурга. Ему же принадлежит установление термина "дезинсекция".
Занимался Н. Ф. Гамалея и изучением гриппа. Он предложил свой метод профилактики (предупреждения) этой болезни. В последние годы своей жизни Николай Федорович разработал особый метод лечения туберкулеза при помощи препаратов «микола» и «тиссулина», которые используются и в настоящее время.
Н. Ф. Гамалея был выдающимся организатором и руководителем многих лабораторий и институтов в Одессе, Петрограде, Москве. Он был первым и бессменным председателем Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов и инфекционистов. Николай Федорович был избран почетным членом Академии наук СССР, ему была присуждена Государственная премия. Н.Ф.Гамалея награжден двумя орденами Ленина, орденом Трудового Красного Знамени