- Выполнено первое систематическое исследование молекулярных механизмов высокоспецифичного аминоацилирования тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой, имеющей редкую структуру (αβ)2-типа. Независимые измерения равновесных констант диссоциации комплексов PheRS с разными тРНК и кинетических параметров аминоацилирования позволили идентифицировать нуклеотиды, обеспечивающие распознавание тРНК ферментом на стадии связывания и каталитического превращения, и различить непрямые элементы специфичности по их роли в создании оптимальной конформации тРНК. Впервые для локализации нуклеотидов, образующих близкие контакты с синтетазой, применена s4U-индуцируемая аффинная модификация статистически замещенными аналогами тРНК-транскриптов, что позволило зафиксировать взаимодействия между PheRS и непрямыми элементами узнавания, участвующими в конформационной адаптации комплекса. Результаты исследований в растворе подтверждены и дополнены данными РСА: конформационно подвижные нуклеотиды, модулирующие структуру тРНК в разных функциональных состояниях комплекса, идентифицированы сравнительным изучением трехмерных структур комплексов PheRS с тРНКPhe, закристаллизованных в отсутствие или в присутствии устойчивого аналога фенилаланиладенилата. Впервые продемонстрирована результативность метода аффинной модификации аминоацил-тРНК-синтетазы производными специфичной тРНК и ее мутантных форм для непосредственной регистрации участия различных элементов узнавания в создании комплекса с правильной ориентацией акцепторного конца. В работе впервые показан другой важный аспект применения таких аффинных тРНК-реагентов - установление роли малых субстратов в продуктивном связывании акцепторного конца тРНК ферментом. Фотоаффинные, s4U(s6G)-замещенные в 3′-концевой последовательности, аналоги тРНК синтезированы впервые и могут оказаться полезными для структурно-функциональных исследований комплексов различных тРНК с другими компонентами аппарата трансляции. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности комплексного применения химических и биохимических методов в сочетании с РСА для решения проблемы узнавания тРНК ключевыми ферментами биосинтеза белка.
- Выявленные молекулярные детали взаимодействия PheRS с малыми специфичными и неспецифичными лигандами важны как для понимания механизма функционирования наиболее сложноорганизованной aaRS, так и для решения биотехнологических задач по созданию белков с необычными свойствами. На их основе конструируются мутантные формы PheRS, пригодные для функционализации рекомбинантных белков (Datta et al., 2002; Kwon & Tirrel, 2007). Другая область практического применения - оптимизация структуры ингибиторов PheRSs, обладающих антибактериальным действием (Yu et al., 2004; Jarvest et al., 2005).
1. Lavrik O.I., Moor N.A., Reshetnikova L.S., Ankilova V.N., Khodyreva S.N., Stepanov V.G. Phenylalanyl-tRNA synthetase from an extreme thermophile: structure-function analysis of enzyme and its interaction with tRNAPhe // Evolutionary biochemistry and related areas of physicochemical biology / Poglazov B.F., Kurganov B.I., Kritsky M.S. and Gladilin K.L. Eds. Moscow: Bach Institute of Biochemistry and ANKO. 1995. P. 327-340.
2.Иванов К.А., Моор Н.А., Лаврик О.И. Неканонические функции аминоацил-тРНК-синтетаз // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1047-1057.
3.Safro M., Moor N., Lavrik O. Phenylalanyl-tRNA synthetase // The aminoacyl-tRNA synthetases / Ibba M., Francklyn C. and Cusack S. Eds. Georgetown, TX: Landes Bioscience. 2005. P. 250–265.
4.Васильева И.А., Моор Н.А. Взаимодействие аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК: общие закономерности и особенности узнавания высокомолекулярного субстрата // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 306-324.
Статьи в научных журналах
5.Moor N., Nazarenko I., Ankilova V., Khodyreva S., Lavrik O. Determination of tRNAPhe recognition nucleotides for phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus // Biochimie. 1992. V. 74. P. 353-356.
6.Stepanov V.G., Moor N.A., Ankilova V.N., Lavrik O.I. Phenylalanyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus can attach two molecules of phenylalanine to tRNAPhe // FEBS Lett. 1992. V. 311. P. 192-194.
7.Моор Н.А., Степанов В.Г., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Врацких Л.В., Ямковой В.И., Моторин Ю.А., Лаврик О.И. Роль 3´-ССА-последовательности во взаимодействии тРНКPhe из E. coli и Thermus thermophilus c гомологичными фенилаланил-тРНК-синтетазами // Биохимия. 1994. T. 59. C. 1299-1303.
8.Moor N.A., Repkova M.N., Yamkovoy V.I., Lavrik O.I. Alterations at the 3´-CCA end of Escherichia coli and Thermus thermophilus tRNAPhe do not abolish their acceptor activity // FEBS Lett. 1994. V. 351. P. 241-242.
9.Степанов В.Г., Моор Н.А., Анкилова В.Н., Васильева И.А., Лаврик О.И. Механизм образования бис-2´,3´-O-фенилаланил-тРНКPhe в реакции аминоацилирования тРНК, катализируемой фенилаланил-тРНК-синтетазой из Thermus thermophilus // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 671-678.
10.Moor N.A., Ankilova V.N., Lavrik O.I. Recognition of tRNAPhe by phenylalanyl-tRNA synthetase of Thermus thermophilus // Eur. J. Biochem. 1995. V. 234. P. 897-902.
11.Moor N.A., Favre A., Lavrik O.I. Сovalent complex of phenylalanyl-tRNA synthetase with 4-thiouridine-substituted tRNAPhe gene transcript retains aminoacylation activity // FEBS Lett. 1998. V. 427. P. 1-4.
12.Stepanov V.G., Moor N.A., Ankilova V.N., Vasil´eva I.A., Sukhanova M.V., Lavrik O.I. A peculiarity of the reaction of tRNA aminoacylation catalyzed by phenylalanyl-tRNA synthetase from an extreme thermophile Thermus thermophilus // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1386. P. 1-15.
13.Моор Н.A., Степанов В.Г., Анкилова В.Н., Фавр А., Лаврик О.И. Аффинная модификация фенилаланил-тРНК-синтетазы аналогами тРНК, содержащими 4-тиоуридин // Биохимия. 1998. T. 63. C. 1222-1230.
14.Моор Н.А., Анкилова В.Н., Фавр А., Лаврик О.И. Локализация участка связывания 3´-концевой последовательности тРНКPhe на субъединицах фенилаланил-тРНК-синтетазы T. thermophilus // Биохимия. 1998. T. 63. C. 1231-1237.
15.Reshetnikova L., Moor N., Lavrik O., Vassylyev D.G. Crystal structures of phenylalanyl-tRNA synthetase complexed with phenylalanine and a phenylalanyl-adenylate analogue // J. Mol. Biol. 1999. V. 287. P. 555-568.
16.Васильева И.А., Анкилова В.Н., Лаврик О.И., Моор Н.А. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы Thermus thermophilus с 3´-концевым нуклеотидом тРНКPhe // Биохимия. 2000. T. 65. C. 1368-1379.
17.Moor N.A., Ankilova V.N., Lavrik O.I., Favre A. Determination of tRNAPhe nucleotides contacting the subunits of Thermus thermophilus phenylalanyl-tRNA synthetase by photoaffinity crosslinking // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1518. P. 226–236.
18.Fishman R., Ankilova V., Moor N., Safro M. Crystal structure at 2.6 Å resolution of phenylalanyl-tRNA synthetase complexed with phenylalanyl-adenylate in the presence of manganese // Acta Crytallogr. 2001. V. D57. P. 1534-1544.
19.Moor N., Linshiz G., Safro M. Cloning and expression of human phenylalanyl-tRNA synthetase in Escherichia coli: comparative study of purified recombinant enzymes // Protein Expr. Purif. 2002. V. 24. P. 260-267.
20.Vasil´eva I.A., Ankilova V.N., Lavrik O.I., Moor N.A. tRNA discrimination by T. thermophilus phenylalanyl-tRNA synthetase at the binding step // J. Mol. Recognit. 2002. V. 15. P. 188-196.
21.Moor N., Lavrik O., Favre A., Safro M. Prokaryotic and eukaryotic tetrameric phenylalanyl-tRNA synthetases display conservation of the binding mode of the tRNAPhe CCA end // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 10697-10708.
22.Васильева И.А., Богачев В.С., Фавр А., Лаврик О.И., Моор Н.А. Роль низкомолекулярных субстратов в функциональном связывании акцепторного конца тРНКPhe фенилаланил-тРНК-синтетазой // Биохимия. 2004. T. 69. C. 179-191.
23.Васильева И.А., Фавр А., Лаврик О.И., Моор Н.А. Влияние нуклеотидных замен в тРНКPhe на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фенилаланил-тРНК-синтетазой // Биохимия. 2004. T. 69. C. 192-203.
24.Kotik-Kogan O., Moor N., Tworowski D., Safro M. Structural basis for discrimination of L-phenylalanine from L-tyrosine by phenylalanyl-tRNA synthetase // Structure. 2005. V. 13. P. 1799–1807.
25.Moor N., Kotik-Kogan O., Tworowski D., Sukhanova M., Safro M. The crystal structure of the ternary complex of phenylalanyl-tRNA synthetase with tRNAPhe and a phenylalanyl-adenylate analogue reveals a conformational switch of the CCA end // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 10572–10583.