- В настоящей работе продемонстрирована и детально исследована Са2+- зависимая регуляция фосфорилирования родопсина в наружных сегментах палочки (НСП) сетчатки быка и доказано, что ингибирующий эффект ионов кальция на фосфорилирование родопсина опосредован рековерином. Установлено, что клеточной мишенью для рековерина служит родопсинкиназа; эти данные говорят о том, что рековерин in vivo выполняет функцию «кальциевого сенсора» для родопсинкиназы. Показано, что эффективность рековерина как Са2+-зависимого ингибитора значительно выше в реакции фосфорилирования «темнового», чем фотоактивированного родопсина; высказана оригинальная гипотеза, предполагающая, что одна из функций рековерина в фоторецепторной клетке - предотвращение нежелательной реакции фосфорилирования «темнового» родопсна и тем самым создание благоприятных условий для выполнения родопсинкиназой ее основной функции - фосфорилирование фотовозбужденного рековерина. Показано, что N-концевое миристоилирование рековерина увеличивает его ингибирующую эффективность в реакции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой. Наши данные также показывают, что холестерин, входящий в состав фоторецепторных мембран, способствует связыванию рековерина с мембранами и усиливает ингибирование родопсинкиназы посредством сдвига полумаксимального эффекта ингибирования родопсинкиназа в сторону низких значений концентраций свободного кальция и рековерина.
- Установлена специфическая роль каждого из двух функционирующих в рековерине Са2+-связывающих центров (EF2 и EF3) в механизме его Са2+-миристоильного переключателя. Получены прямые экспериментальные доказательства последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерина ионами кальция. Обнаружено, что для функционирования механизма последовательного заполнения Са2+-связывающих центров рековерин должен быть миристоилирован. Определены кинетические параметры, характеризующие взаимодействие рековерина с искусственными липидными мембранами. Впервые продемонстрировано, что Са2+-связывающий центр EF2 рековерина непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного "кармана" и миристоильного остатка, а также Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином. Методом ренгрено-структурного анализа охарактеризована пространственная структура мутанта рековерина с выключенным EF2, что позволило выявить последовательность структурных перестроек в молекуле белка, сопутствующие процессу экспонирования миристоильного остатка при последовательном заполнении кальцием Са2+-связывающих центров рековерина.
- Выявлена роль функционального четвертого Са2+-связывающего центра рековерина. Установлена функция реконструированного Са2+-связывающего центра EF4 в процессе связывания рековерина с фоторецепторной мембраной и в процессе ингибирования фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой. Получены прямые экспериментальные доказательства того, что активный Са2+-связывающий центр EF4 в молекуле рековерина может функционально компенсировать отсутствие связывания ионов кальция в третьем, но не во втором Са2+-связывающем центре. Получено независимое доказательство гипотезы о том, что второй Са2+-связывающий центр молекулы рековерина контролирует время нахождения белка на мембране, а следовательно и Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином.
- Показано, что нарушение регуляции рековерином фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой может лежать в основе молекулярных механизмов патогенеза таких заболеваний сетчатки, как пигментный ретинит и паранеопластическая ретинопатия.
2.Gorodovikova E.N., Senin I.I., Philippov P.P. Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted system consisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recoverin. // FEBS Lett., 1994, v. 353, p. 171-172.
3.Senin I.I., Zargarov A.A., Alekseev A.M., Gorodovikova E.N., Lipkin V.M., Philippov P.P. N- Myristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase. // FEBS Lett., 1995, v. 376, p. 87-90.
4.Заргаров А.А., Сенин И.И., Алексеев А.М., Шульга-Морской С.В., Филиппов П.П., Липкин В.М. Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина в клетках E.coli и сравнение их функциональной активности. // Биоорган. Химия, 1996, т. 22, № 7, с. 483-488.
5.Senin I.I., Dean K.R., Zargarov A.A., Akhtar M., Philippov P.P. Recoverin inhibits the phosphorylation of dark-adapted rhodopsin more than it does that of bleached rhodopsin: A possible mechanism through which rhodopsin kinase is prevented from participation in a side-reaction. // Biochem. J., 1997, v. 321, p. 551-555.
6.Senin I.I., Zargarov A.A., Akhtar M., Philippov P.P. (1997) Rhodopsin phosphorylation in bovine rod outer segments is more sensitive to the inhibitory action of recoverin at the low rhodopsin bleaching than it is at the high bleaching. // FEBS Lett., 1997, v. 408, p. 251-254.
7.Alekseev A.M., Shulga-Morskoy S.V., Zinchenko D.V., Shulga-Morskaya S.A., Suchkov D.V., Vaganova S.A., Senin I.I., Zargarov A.A., Lipkin V.M., Akhtar M., Philippov P.P. Obtaining and characterization of EF-hand mutants of recoverin. // FEBS Lett., 1998, v. 440, p. 116-118.
8.Пермяков С.Е., Сенин И.И., Уверский В.Н., Черская А.М., Шульга-Морской С.В., Зинченко Д.В., Алексеев А.М., Заргаров А.А., Липкин В.М., Филиппов П.П., Пермяков Е.А. Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина. I. Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров. // Биоорган. химия, 1999, т.25, ;№ , с.742-746.
9.Уверский В.Н., Пермяков С.Е., Сенин И.И., Черская А.М., Шульга-Морской С.В., Зинченко Д.В., Алексеев А.М., Заргаров А.А., Липкин В.М., Филиппов П.П., Пермяков Е.А. Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина. II. Необычное поведение белка при взаимодействии с ионами кальция. // Биоорган. химия, 2000, т.26, ;№ , с.173-178.
10.Пермяков С.Е., Уверский В.Н., Черская А.М., Шульга-Морской С.В., Зинченко Д.В., Алексеев А.М., Зерний Е.Ю., Заргаров А.А., Сенин И.И., Липкин В.М., Филиппов П.П., Пермяков Е.А. Точечные аминокислотные замены в Са2+-связывющих центров рековерина. III. Мутант с четвертым реконструированным Са2+-связывающим центром. // Биоорган. химия, 2000, т.26, ;№ , с. 275-283.
11.Permyakov S.E., Cherskaya A.M., Senin I.I., Zargarov A.A., Shulga-Morskoy S.V., Alekseev A.M., Zinchenko D.V., Lipkin V.M., Philippov P.P., Uversky V.N., Permyakov E.A. (2000) Effects of mutations in the calcium-binding sites of recoverin on its calcium affinity: evidence for successive filling of the сalcium binding sites. // Protein Eng., 2000, v.13, p. 783-790.
12.Bazhin A.V., Shifrina O.N., Savchenko M.S., Tikhomirova N.K., Goncharskayj M.A., Gorbunova V.A., Senin I.I., Chuhalin A.G., Philippov P.P. Low titre autoantibodies against recoverin in sera of patients with small cell lung cancer but without a loss of vision. // Lung cancer, 2001, v.34, p.99-104.
13.Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П. Влияние протеолитического отщепления С- концевого фрагмента родопсина на его способность активировать зрительный каскад. // Биоорган. химия, 2002, т. 28, № , с. 16-22.
14.Senin I.I., Koch K.-W., Akhtar M., Philippov P.P. Ca2+-Dependent Control of Rhodopsin Phosphorylation: Recoverin and Rhodopsin Kinase. // Adv. Exp. Med. Biol., 2002, v. 514, p.69-99.
15.Fisher T., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Application of different lipid surfaces to monitor protein-membrane interaction by surface plasmon resonance spectroscopy. // Spectroscopy, 2002, v.16, p. 271 – 279.
16.Senin I.I., Fisher T., Komolov K.E., Zinchenko D.V., Philippov P.P., Koch K.-W. Ca2+-myristoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2+-binding sites. // J. Biol. Chem., 2002, v. 277, № 52, p.50365-50372.
17.Зериний Е.Ю., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Сенин И.И. Обнаружение аннексина IV в палочках сетчатки быка. // Биохимия, 2003, т. 68, № 1, с. 154-160.
18.Permyakov S.E., Cherskaya A.M., Wasserman L.A., Khokhlova T.I., Senin I.I., Zargarov A.A., Zinchenko D.V., Zernii E.Yu., Lipkin V.M., Philippov P.P., Uversky V.N, Permyakov E.A. Recoverin Is a Zinc-Binding Protein // J. Proteome Res., 2003, v.2, № 1, p.51-57.
19.Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., Granzin J., Koch K-W. Impact of N-terminal myristoylation on the Ca2+-dependent conformational transition in recoverin. // J. Biol. Chem., 2003, v. 278, № 25, p.22972-22979.
20.Senin I.I., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Ergorov N.S., Philippov P.P., Koch K-W. Functional restoration of the Ca2+-myrisсчссс ьт0447кччкчякщкукщщзк3зщщ03к2я32toyl switch in a recoverin mutant. // J. Mol. Biol., 2003, v. 330, № 2, p.409-418.
21.Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П. Зрительная трансдукция и кальций. // Биофизика, 2004, т. 49, №2, с. 265-77.
22.Zernii E.Yu., Tikhomirova N.K., Hellman U., Philippov P.P. and Senin I.I. Annexins in bovine photoreceptors. // Annexins, 2004, v.1, № 1, p.63-69.
23.Senin I.I., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments. // J. Biol. Chem., 2004, v.279, № 47, p. 48647-48653.
24.Тихомирова Н.К., Гончарская М.А., Сенин И.И. Получение и характеристика Са2+-зависимых моноклональных антител против рековерина. // Биохимия, 2004, т. 69, № 12, с. 1360-1364.
25.Komolov K.E., Zinchenko D.V., Churumova V.A., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., and Koch K.W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase. // Biol. Chem., 2005, v.386, № 3, p. 285-289.
26.Komolov K.E., Senin I.I., Philippov P.P., and Koch K.W. Surface plasmon resonance study of G-protein/receptor coupling in a lipid bilayer-free system. // Anal. Chem., 2006, v. 78, № 4, p. 1228-1234.
27.Senin I.I., Bosch L., Ramon E., Zernii E.Yu., Manyosa J., Philippov P.P., and Garriga P. Ca2+/recoverin dependent regulation of phosphorylation of the rhodopsin mutant R135L associated with retinitis pigmentosa. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, v. 349, № 1, p. 345-352.
28.Weiergräber O.H., Senin I.I., Zernii E.Yu. Churumova V.A., Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., and Koch K.W. Tuning of a Neuronal Calcium Sensor. // J.Biol.Chem., 2006, v. 281, № , p. 37594 – 37602.
29.Gensch T., Komolov K.E., Senin I.I., Philippov P.P., and Koch K.W. Ca2+-dependent conformational changes in the neuronal Ca2+-sensor recoverin probed by the fluorescent dye Alexa647. // Proteins, 2007, v. 66, № 2, p. 492-499.
30.Ramon E., Cordomí A., Bosch L., Zernii E.Yu., Senin I.I., Manyosa J., Philippov P.P., Pérez J.J., and Garriga P. Critical Role of Electrostatic Interactions of Amino Acids at the Cytoplasmic Region of Helices 3 and 6 in Rhodopsin Conformational Properties and Activation. // J.Biol.Chem., 2007; v. 282, № , p. 14272 - 14282.
31.Senin I.I., Churumova V.A., Philippov P.P., Koch K.W. Membrane binding of neuronal calcium sensor recoverin – modulatory role of the charged carboxy-terminus. // BMC Biochem., 2008, v.8, p.24-29.