- В настоящее время, практически отсутствуют прямые методы, позволяющие изучать структурные свойства белков адсорбированных на поверхностях раздела фаз. Данных по структуре белков и белок-содержащих надмолекулярных ансамблей на поверхностях раздела фаз в литературе практически не встречается. В представленной работе впервые разработаны принципиально новые подходы, позволяющие исследовать структурные свойства белков адсорбированных на поверхности раздела фаз на основе высокочувствительных микроспектроскопических методов, применяемых для изучения структурных свойств белков в гомогенных системах. Суть разработанных подходов состоит в применении методов разрешенно-временной флуоресцентной спектроскопии и ИК спектроскопии в режиме внешнего отражения (соответственно, ER-TRFA и IRRAS) и разработка соответствующих методов спектральной симуляции для получения количественной информации о свойствах белков (концентрации, конформации, степени агрегации, молекулярной подвижности) адсорбированных на поверхности вода-воздух. Кроме того, для получения информации о диффузионных свойствах белков на поверхности раздела фаз впервые адаптирован и применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Впервые показано, что данные методы (ER-TRFA и IRRAS и FCS) чувствительны к изменениям пространственной структуры, общей и внутренней молекулярной динамики белков, а также состояния агрегации белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. Продемонстрировано, что разработанные методы, ER-TRFA, FCS и IRRAS применимы как в случае моно-, так и мультикомпонентных коллоидных систем различного состава. С применением комбинации данных методов впервые получена детальная количественная информация о распределении белка в поверхностном слое, кинетике адсорбции, а также о структурнодинамических свойствах белков адсорбированных на поверхности вода-воздух. Показано, что применение комбинации методов ER-TRFA, FCS и IRRAS открывает новые возможности для исследования на молекулярном уровне механизмов адсорбции биополимеров и их комплексов на поверхностях раздела фаз.
- С применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ, позволяющей целенаправленно регулировать олигомерный состав ферментов, был разработан принципиально новый метод для проведения рефолдинга рекомбинантных ферментов, образующихся в виде тел включения. Эффективность и универсальность предложенного метода была продемонстрирована на примере ферментов: галактозооксидаз (Fusgalox и Sagalox) и альдонолактоноксидазы (TcGAL).
- Предложены новые подходы для исследования механизмов регуляции функционирования олигомерных и мембранотропных ферментов с применением модельной системы обращенных мицелл ПАВ. Изучена роль межсубъединичных взаимодействий в функционировании олигомерных ферментов на примере п-гидроксибензоат гидроксилазы (РНВН) и галактозооксидазы (Fusgalox). Были впервые получены полностью активные олигомерные формы данных ферментов, не реализующиеся в водных растворах, мономерная - в случае РНВН и димерная и тетрамерная - в случае Fusgalox. Найдено, что каталитическая эффективность полученных олигомерных форм выше по сравнению с таковыми в водном растворе, как в случае РНВН, так и Fusgalox. Установлено, что в случае РНВН механизм изменения каталитических параметров при образовании мономера, связан с конформационными перестройками в молекуле фермента при диссоциации димера, приводящими с одной стороны к увеличению каталитической активности, а с другой стороны - к инактивации и агрегации мономерной формы в водном растворе. Показано, что образование димера играет ключевую роль в поддержании нативной конформации фермента в случае РНВН.
- Предложен новый подход для исследования влияния липидного состава матрицы на функционирование мембранотропных ферментов, основанный на применении системы обращенных мицелл. Показано, что данный подход является исключительно информативным для проведения такого исследования: позволяет варьировать липидный состав мицеллярной матрицы путем получения смешанных мицелл; учитывать влияние химической природы липидов на каждую из олигомерных форм фермента, а также исследовать влияние структуры липида на мембранотропные свойства фермента. На примере периферического мембранного фермента, кислой фосфатазы (КФ), показано, что липидный состав матрицы играет ключевую роль в функционировании мембранотропных ферментов. Показано, что влияние липидного состава системы на каталитические свойства КФ могут быть вызваны как влиянием липидного состава системы на структуру и свойства мицелл, так и являться следствием белок-липидных взаимодействий.
- Детально изучен молекулярный механизм влияния комплексообразования с полиэлектролитами (ПЭ) на структурно-функциональные свойства ферментов и белков. Найдено, что взаимодействие белков с ПЭ приводит к образованию квази-регулярной компактной структуры комплекса двух уровней: внутренняя, доменная структура и общая - глобуло-подобная. Обнаружено, что в водно-органических системах, а также при адсорбции на гидрофобных поверхностях эффективность взаимодействия белков с ПЭ усиливается, что приводит к снижению константы диссоциации комплексов и образованию более конденсированной структуры комплекса. Найдено, что образование таких структур приводит к ограничению как общей, так и внутренней подвижности фермента (увеличивает жесткость активного центра). Впервые показано, что образование компактной и упорядоченной структуры фермент-ПЭ комплексов является основной причиной активационного и стабилизационного эффектов, наблюдаемых в водно-органических системах.
1.Е.В. Кудряшова, И.С. Васильева, И.Н. Зоров, А.П. Синицын, А.В. Левашов. Стабилизация щелочной протеиназы и целлюлаз комплексообразованием с хитозаном для применения в составе синтетических моющих средств. Биоорганическая химия. 2009. 35(3) с. 1-8.
2.Е.В. Кудряшова, В.Л. Бронза, А.В. Левашов. Влияние липидов на каталитическую активность кислой фосфатазы в системе обращенных мицелл. Биохимия. 2009. 74(3) с. 420 - 428.
3.E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, W.J.H. van Berkel. Monomer formation and functioning of p-hydroxybenzoate hydroxylase in reverse micelles and in dimethylsulfoxide-water mixtures. ChemBiochem. 2008, 9(3). 413-419.
4.E.V. Kudryashova, H.H.J. de Jongh. Modulation of the adsorption properties of the complex of egg white ovalbumin with pectin by the dielectric constant. J. Coll. Int. Sci. 2007, 318(2). 430-439.
5.E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de Jongh. Molecular details of ovalbumin-pectin complexes at the air/water interface: a spectroscopic study. Langmuir. 2007. 23(15). 7942-7950.
6.E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, H.H.J. de Jongh. Reversible self-association of ovalbumin at air-water interfaces and the consequences for the exerted surface pressure. 2005. Protein Science. 14(2). 483-493.
7.H.H.J. de Jongh, H.A. Kosters, E.V. Kudryashova, M.B.J. Meinders, D. Trofimova, P.A. Wierenga. Protein adsorption at air-water interface: a combination of details. 2004. Biopolymers. 74. 131-135.
8.E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser, A.V. Levashov. Stabilization of a-chymotrypsin by formation of quasi-regular compact structure of enzyme-polyelectrolyte complexes. 2004. Article in Proceedings. The InternationalSymposium "Highly-Organizedcatalytic systems". Moscow. 2004.
9.E.V. Kudryashova, M.B.J. Meinders, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de Jongh. Structural properties and rotational dynamics of egg white ovalbumin adsorbed at the air/water interface. 2003. Eur. Biophys. J, 32. 553-562.
10.E.V. Kudryashova, T.A. Artemova, A.A. Vinogradov, A.K. Gladilin, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization and activation of a-chymotrypsin in water-organic solvent systems by complex formation with oligoamines. 2003. Protein Eng. 16 (4). 303-309.
11.A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov, W.M.A.M. van Dongen. Solubilization and refolding of inclusion body proteins in reverse micelles. Analytical Biochemistry. 2003. 320. 234-238.
12.E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Levashov. Белки (ферменты) в надмолекулярных ансамблях: исследование структурной организации методом разрешенно-временной анизотропии. Успехи Биол. Химии. 2002. 42. 257-294.
13.A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, V.Ya. Grinberg, N.V. Grinberg, T.V. Burova, A.V. Levashov. The chemical modification of a-chymotrypsin with both hydrophobic and hydrophilic compounds stabilizes the enzyme against denaturation in water-organic media. 2001. Protein Eng. 14(9). 683-689.
14.E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, V.A. Izumrudov, A. van Hoek, A.J.W.G. Visser, A. V. Levashov. Formation of Quasi-Regular Compact Structure of Poly(methacrylic acid) upon an Interaction with Chymotrypsin. 2001. Biochim. Biophys. Acta. 1550 (2). 129-143.
15.E.V. Kudryashova, T.M. Artemova, A.K. Gladilin, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. The design of supramolecular biocatalytic assembles in water-organic solvent mixtures by using complex formation with PE and OA. 1999. Article in Proceedings. The International Symposium on "Lipid and Surfactant Dispersed Systems". Moscow. 1999. pp. 55-56.
16.E.V. Kudryashova, V.V. Mozhaev, C. Balny. Catalytic activity of thermolysin under extremes of pressure and temperature: modulation by metal ions. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1386. 199-210.
17.E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Vakurov, F. Heitz, A.V. Levashov, V.V. Mozhaev. Enzyme-polyelectrolyte cоmplexes in water-cosolvent mixtures. Negatively charged groups artificially introduced into a-chymotrypsin provide additional activation and stabilization effects. 1997. Biotechnology & Bioengineering. 55 (2). 267-277.
18.V.V. Mozhaev, E.V. Kudryashova, N.V. Efremova, I.N. Topchieva. Stability of chymotrypsin conjugated with poly(ethylene glycols) and proxanols at high temperature and in water-cosolvent mixtures. 1996. Biotechnology Techniques. 10 (11). 849-854.
19.V.V. Mozhaev, E.V. Kudryashova, N. Bec. Modulation of enzyme activity and stability by high pressure: a-chymotrypsin. 1996. R. Hayashi and C. Balny (Editors). High Pressure Bioscience and Biotechnology. Elsevier Science. 221-226.
20.V.V. Mozhaev, R. Lange, E.V. Kudryashova, C. Balny. Application of high hydrostatic pressure for increasing activity and stability of enzymes. 1996. Biotechnology & Bioengineering. 52(2). 320-331.
21.E.V. Kudryashova, I.B. Galperin, A.K. Gladilin, A.V. Levashov. Stabilization of peroxidase by non-covalent complex formation with polyelectrolytes in water-cosolvent mixtures. 1996. In: "Plant peroxidases. Biochemistry and physiology", C. Obinger, U. Burner, H. Grippin, eds., Geneva. 1996. pp. 390-395.
22.A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Enzyme-polyelectrolyte noncovalent complexes as catalysts in binary mixtures of polar organic solvents with water. 1995. Biotechnol. Lett. 17. 1329-1334.
23.Е.В. Кудряшова, A.E. Белова, A.A. Виноградов, В.В. Можаев. Влияние гидрофобных свойств поверхности белка на устойчивость к денатурации в органических растворителях. 1994. Биоорганическая химия. 20(3). 274-280.
Конференции
1.H.H.J. de Jongh, E.V. Kudryashova, P.A. Wierenga, R.A. Ganzevles. Polyelectrolytes as modulator of interfacial properties in food-related systems. Polyelectrolytes. 2008. Coimbra. Portugal.
2.E.V. Kudryashova, A.J.W.G. Visser and A.V. Levashov. Stabilization and Activation of a-Chymotrypsin by Formation of Quasi-Regular Compact Structure of Enzyme-Polyelectrolyte Complexes. Highly-Organized catalytic systems. 2004. Moscow. Russia.
3.V.L. Bronza, E.V. Kudryashova, and A.V. Levashov. Regulation of catalytic activity of acid phosphatase by lipids in reverse micellar system. International Symposium on Engineering and Understanding Protein Functionality. 2003. Moscow. Russia.
4.A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov, W.M.A.M. van Dongen. The use of reverse micellar system for solubilization and refolding of inclusion bodies protein. International Symposium on Engineering and Understanding Protein Functionality. 2003. Moscow. Russia.
5.E.V. Kudryashova, M. Meinders, A.J.W.G. Visser, A. Hoek, H.H.J. de Jongh, Molecular properties of ovalbumin at air/water interface. The 14th Surfactant in Solution Symposium (SIS-2002). 2002. Barcelona. Spain.
6.A.A. Vinogradov, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov, W.M.A.M. van Dongen. Solubilization of inclusion bodies protein in reverse micelles. The 14th Surfactant in Solution Symposium (SIS-2002). 2002. Barcelona. Spain.
7.E.V. Kudryashova, T.M. Artemova, M. Meinders, H.H.J. de Jongh, A.V. Levashov. Modification of ovalbumin at air/water interface for stabilization of "interfacial" protein conformation. The International Conference "Biocatalysis". 2002. Moscow. Russia.
8.Е.В. Кудряшова, А.В. Левашов. каталитическая активность и структура комплексов ферментов с поли-и олигоэлектролитами в водно-органических системах. 5 Международный Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». 2002. Москва, Россия.
9.E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization of the proteins by non-covalent complex formation with polyelectrolytes. The International Symposium "Folding". 2000. Moscow. Russia.
10.E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Levashov. Physico-chemical mechanism of enzyme-polyelectrolyte complex formation. The International Conference "Biocatalysis". 2000. Moscow. Russia.
11.E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Levashov, V.V. Mozhaev. Cоmplex formation with oligoamines provides for enzyme stabilization in water-organic cosolvent mixtures. The International Symposium on protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical aspects, 1998, Moscow, Russia. 163.
12.E.V. Kudryashova, V.V. Mozhaev, C. Balny. Catalytic activity of thermolysin under extremes of pressure and temperature: modulation by metal ions. The International Symposium on High Pressure Bioscience and Biotechnology. 1998. Lisbon. Portugal.
13.A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, A.V. Levashov, V.V. Mozhaev. Enzyme-polyelectrolyte cоmplexes in water-organic mixtures. Influence of the number of sites for electrostatic binding to a polyelectrolyte on the catalytic activity of chymotrypsin in the complex with polybrene. The International Conference Biocatalysis: Fundamentals and Applications, 1998, Puschino, Russia, 4.
14.A.K. Gladilin, A.V. Vakurov, M.V. Kiselev, E.V. Kudryashova, A.V. Levashov. Proteins in systems with organic solvents: stabilization by wimplex formation with polyelectrolyte. The International Symposium on protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical aspects, 1998, Moscow, Russia. 57.
15.А.В. Вакуров, Е.В. Кудряшова, А.К. Гладилин, В.А. Изумрудов, В.В. Можаев, А.В. Левашов. Нековалентные комплексы протеолитических ферментов с полиэлектролитами в водно-органических смесях. 6 Симпозиум по химии протеолитических ферментов, Москва, 1997, 119.
16.А.К. Гладилин, Е.В. Кудряшова, А.В. Вакуров, И.В. Гальперин, В.А. Изумрудов, В.В. Можаев, А.В. Левашов. Стабилизация ферментов в водно-органических смесях путем нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами. 2 Съезд Биохимического общества РАН, Москва, 1997, 7.
17.E.V. Kudryashova, I.B. Galperin, A.K. Gladilin, S.N. Nametkin, A.V. Levashov. Peroxidase in water-alcohol mixtures: catalytic behavior and stabilization by complex formation with polycation. The 4th International Symposium on "Plant peroxidases biochemistry and Physiology". 1996. Vienna. Austria. РА-43.
18.E.V. Kudryashova, A.A. Vinogradov, V.V. Mozhaev. Covalent modification imparts additional stability to enzymes in organic solvents. The 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. 1994. New Delhi. India.
19.A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Enzyme-polycation inter-polyelectrolyte complexes. A new approach to enzyme stabilization in organic media. The 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, New Delhi. India. 1994, 2, 219.
20.A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization of enzymes in water-organic mixtures by incorporation into non-covalent complexes with polycations. The International Symposium on Molecular mobility and order in polymer systems. St. Petersburg. Russia. 1994, Р - 12.
21.Е.В. Кудряшова, А.Б. Белова, В.В. Можаев. Гидрофилизация поверхности химотрипсина увеличивает его устойчивость к денатурации органическими растворителями. 3 Всероссийский Симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 1993, 121.