- Физико-химические исследования модифицированных дуплексов ДНК осуществлены как традиционными методами, так и с привлечением новых подходов, основанных на использовании параллельных методов анализа. Разработка синтетических платформ для реализации этих новых подходов представляется одним из наиболее значимых результатов настоящего исследования. Предложенные в настоящей работе методы иммобилизации олигонуклеотидов в сшитых гидрофильных полимерах являются базовыми для нескольких поколений олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов. Три принципиально различных подхода к иммобилизации предоставляют возможность выбора технологического решения при изготовлении гидрогелевых трехмерных микрочипов -традиционная иммобилизация, фотонаправленный синтез или сополимеризация модифицированных олигонуклеотидов с акриловыми мономерами. Параллельный анализ образования дуплексов на олигонуклеотидных микрочипах широко используется в настоящее время для решения широкого круга биологических и диагностических задач. Однако, возможности этого метода как инструмента физико-химических исследований все еще остаются вне поля зрения исследователей. В настоящей работе впервые представлен параллельный физико-химический анализ образования модифицированных дуплексов ДНК на матрице 4096 иммобилизованных гексануклеотидов.
- Проведен синтез и физико-химические исследования дуплексов ДНК, содержащих неприродные цепи, с целью проследить влияние гидрофобных или ионных модификаций на стабильность двойной спирали. Полученные результаты представляют безусловный интерес при конструировании олигонуклеотидных проб для гибридизационного анализа.
- В ходе выполнения работы впервые было экспериментально доказано образование нового типа триплексов ДНК с химерной ос,Р-третьей цепью. Новый подход к построению третьей цепи - с использованием неприродных аномеров нуклеозидов - позволяет адресовать триплекс-образующие олигонуклеотиды к произвольной последовательности ДНК и не ограничивается полипуриновыми и полипиримидиновыми участками. В работе рассмотрены свойства различных типов триплексов, исследованных с использованием универсальных синтетических конструкций. Предложенный подход к построению внутримолекулярных моделей триплексов ДНК был реализован впервые и обеспечивает заметное повышение стабильности, задает взаимную ориентацию цепей, упрощает термодинамический анализ и сводит к минимуму влияние петли. Благодаря использованию таких моделей удалось экпериментально получить и охарактеризовать параллельный триплекс рекомбинантного типа или R-форму ДНК. Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop IV, VII, VIII (США, 1994, 1999 и 2000), XIII Internationa Round Table «Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications)) (Франция, 1998), XV международная конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2007).
2.A. Schyolkina, O. Mamaeva, O. Borisova, Y. Lysov, E. Timofeev, I. Il´icheva, B. Gottikh and V. Florentiev. 3-stranded clip of the oligonucleotide 5´ -T10-T10-A10 Anisence Res. Develop. 1994, v. 4, pp. 27-33.
3.A. Schyolkina, E. Timofeev, O. Borisova, I. Il´icheva, E. Minyat, E. Khomyakova and V. Florentiev. The R-form of DNA does exist. FEBS Letters v. 339, 1994, pp. 113-118.
4.O. Borisova, A. Schyolkina, E. Timofeev, S. Tsybenko, A. Mirzabekov and V. Florentiev. Stabilization of parallel (recombinant) triplex with propidium iodide. J. Biomol. Struct. Dyn. 1995, v.13, pp. 15-27.
5.О.Ф. Борисова, А.К. Щелкина, Э.Н. Тимофеев, В.Л. Флорентьев. Димеры триплексов ДНК. Молекулярная биология 1995, т.29, с.635-640.
6.A. Schyolkina, O. Borisova, E. Minyat, E. Timofeev, I. Il´icheva, E. Khomyakova and V. Florentiev. Parallel purine-pyrimidine triplex: experimental evidence of existence. FEBS Letters 1995, v.367, pp. 8l-84.
7.E. Timofeev, S. Kochetkova, A. Mirzabekov and V. Florentiev. Regioselective immobilization of short oligonucleotides to acrylic copolymer gels. Nucleic Acids Res. 1996, v.24, pp. 3142-3148.
8.S. Parinov, V. Barskii, G. Yershov, E. Kirillov, E. Timofeev, A. Belgovskiy and A. Mirzabekov. DNA-sequencing by hybridization to microchip octanucleotide and decanucleotide extended by stacked pentanucleotides. Nucleic Acids Res. 1996, v.24, pp. 2998-3004.
9.E. Timofeev, I. Smirnov, L. Haff E. Tischenko, A. Mirzabekov and V. Florentiev. Methidium intercalator inserted into synthetic oligonucleotides. Tetrahedron Letters 1996, v. 37, pp. 8467-8470.
10.D. Proudnikov, E. Timofeev and A. Mirzabekov. Immobilization of DNA in Polyacrylamide Gel for the Manufacture of DNA and DNAOligonucleotide Microchips. Analytical Biochemistry 1998, v. 259, pp 34-41.
11.G. Yershov, E. Timofeev, I. Ivanov, V. Florentiev and A. Mirzabekov. Method of immobilizing water soluble bioorganic compounds on a capillary-porous carrier. US patent 5741700 (1998).
12.A. Mirzabekov, E. Timofeev, V. Florentiev and E. Kirillov. Rapid method to detect duplex formation in sequencing by hybridization. US patent 5,861,247 (1999).
13.V. Vasiliskov., E. Timofeev, S. Surzhikov, A. Drobyshev V. Shick and A. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gelimmobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique 1999, v. 27 pp. 592-4, 596-8, 600 passim.
14.В.А. Василисков, Э.Н. Тимофеев, С.А. Суржиков, А.Л. Дробышев, В.В. Шик, А.Д. Мирзабеков. Метод получения микрочипов с помощью сополимеризации с акриламидом. Молекулярная биология 1998, т. 32, с.923- 925.
15.A. Mirzabekov, D. Proudnikov, E. Timofeev, S. Kochetkova, V. Florentiev and V. Shick. Methods for immobilizing nucleic acids on a gel substrate. US Patent 5,981,734 (1999).
16.S. Sundberg, J. Jacobs, J. Schullek, G. McGall, A. Mirzabekov, E. Timofeev, D. Fujimoto, C. Holmes and H. Yang. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis. US Patent 5,919,523 (1999).
17.S.V. Kochetkova, E.I. Tishchenko, E.N. Timofeev, .I.L. Shchaveleva and V.L. Florentiev. Intercalating insert into internucleotide linkages as way for stabilization and detection of of short DNA duplexes. Nucleos. Nucleot. 1999, v. 18, pp. 1495-1496.
18.A. Stomakhin, V. Vasiliskov, E. Timofeev, D. Shulga, R. Cotter, A. Mirzabekov. DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchips: MALDI mass spectrometry identification of 5mers contiguously stacked to microchip oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2000, v. 28, pp. 1193-1198.
19.Э.Н. Тимофеев, А.Д. Мирзабеков. Способ изготовления микрочипов на основе олигонуклеотидов. Патент РФ 2157385 (2000).
20.Э.Н. Тимофеев, А.Д. Мирзабеков, В. A. Василисков. Способ иммобилизации модифицированных непредельными фрагментами олигонуклеотидов путем сополимеризации. Патент РФ 2157377 (2000).
21.S. A. Surzhikov, E. N. Timofeev, B. K. Chernov, J. B. Golova, A. D. Mirzabekov. Advanced method for oligonucleotide deprotection. Nucleic Acids Res. 2000, v. 15, E29.
22.E. N. Timofeev, O. F. Borisova, A. K. Shchyolkina. Structural polymorphism of oligo(dC) with mixed alpha,beta-anomeric backbone. J. Biomol. Struct. Dyn. 2000, v. 17, pp. 655-664.
23.A. K. Shchyolkina, E. N. Timofeev, Yu P. Lysov, V. L. Florentiev, T. M. Jovin and D. J. Arndt- Jovin. Protein-free parallel triple-stranded DNA complex formation. Nucleic Acids Res. 2001, v. 29, pp. 986-995.
24.E. Timofeev and A. Mirzabekov. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4096-hexanucleotide microarray Nucl. Acids. Res. 2001, v. 29, pp. 2626- 2634.
25.S.V. Kochetkova, E.N. Timofeev, E.A. Korobeinikova, N.A. Kolganova and V.L. Florentiev. Oligodeoxynucleotides with extended zwitter-ionic internucleotide linkage. Tetrahedron. 2001, v. 57, pp. 10287-10292.
26.Н.А. Колганова, С.В. Кочеткова, Э.Н. Тимофеев, Б.П. Готтих, В.Л. Флорентьев. Повышение стабильности дуплексов олигонуклеотидов. Эффект присоединения 1-(2´-дезокси-Р^-рибофуранозил)-5-нитроиндола. Молекулярная биология 2002, т. 36, с. 1-8.
27.A. Mirzabekov, G. Yershov, D. Guschin, M. Gemmel, V. Shick, D. Proudnikov and E. Timofeev. Rapid method to detect duplex formation in sequencing by hybridization methods, a method for constructing containment structures for reagent interaction. US Patent 6,465,174 (2002).
28.A. Mirzabekov, E. Timofeev and V. Vasiliskov. Method of fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. US Patent 6,656,725 (2003).
29.Э.Н. Тимофеев, С.В. Кочеткова, В.Л. Флорентьев. Исследование связывания неприродных а,р-олигоцитидилатов с дуплексами ДНК. Молекулярная биология 2004, т. 38, с. 459-464.
30.E. N. Timofeev, B. V. Goryaeva, V. L. Florentiev Recognition of Base Pair Inversions in Duplex by Chimeric (a,P) Triplex-Forming Oligonucleotides. J. Biomol. Struct. Dynam., 24, No. 2, 183-188 (2006).
31.E. N.Timofeev, S. N. Mikhailov, A. N. Zuev, E. V. Efimtseva, P. Herdewijn, R. L. Somers and M. M. Lemaitre. Oligodeoxynucleotides containing 2´-deoxy-1-methyladenosine and Dimroth rearrangement. Helv. Chim. Acta 2007, v.90, pp. 928-937.
32.Э. Н. Тимофеев, Н. А. Колганова, И. П. Смирнов, С. В. Кочеткова, В. Л. Флорентьев. Олигодезоксинуклеотиды, содержащие замещенные 4-нитроиндолы: синтез и исследование в составе дуплексов ДНК. Биоорг.химия 2008, 34 (2): 220¬226.