- В настоящей работе впервые детально исследованы молекулярные основы спектрального разнообразия белков семейства GFP. В результате проделанной работы показано, что посттрансляционные модификации, приводящие к синтезу различных по структуре хромофоров, используются этими белками в качестве инструмента для «грубой» настройки фотофизических свойств (в пределах 100 нм и более) на определенный спектральный диапазон. «Тонкая» настройка ФБ (в пределах ~ 30 нм) на определенную длину волны осуществляется за счет различных нековалентных взаимодействий хромофора с его аминокислотным окружением.
- Установлено, что, несмотря на исключительное спектральное разнообразие, ФБ семейства GFP используют достаточно консервативные химические механизмы для приобретения этих свойств. Все без исключения ФБ используют структуру п-ГБИ в качестве исходного блока в синтезе хромофора. Впервые показано, что в дальне-красных белках, как и в DsRed, структура п-ГБИ дополнительно модифицирована ацилиминным заместителем, за счет которого происходит расширение π-электронной системы хромофора и спектры приобретают дополнительный сдвиг (~ 110 нм) в длинноволновую область.
- В работе также впервые показано, что ацилимин, являясь довольно реакционноспособной группой, может вступать в дополнительные посттрансляционные реакции, что в свою очередь может служить дополнительным источником спектральной вариабельности. Так хромофор фотоактивируемого белка asFP595 из Anemonia sulcata образуется в результате посттрансляционной реакции гидролиза ацилиминзамещенного п-ГБИ и, таким образом, является производным хромофора DsRed-типа. За счет нуклеофильной реакции по ацилимину также, по-видимому, образуется хромофор в белке zFP538.
- Открыта новая посттрансляционная реакция хромофора белков GFP-семейства. Показано, что белок z2FP574 из Zoanthus sp.2 подвергается окислению-декарбоксилированию, и эта реакция является необходимым условием для перехода белка из зеленого флуоресцентного состояния в красное. Также, впервые показано, что превращение бесцветного нефлуоресцирующего аналога aceGFP-G222E в зеленую флуоресцирующую форму происходит в результате реакции УФ-зависимого окисления хромофора.
- Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современные знания о посттрансляционных модификациях белков семейства GFP. Информация о ковалентных модификациях хромофора и структурных детерминантах, соответствующих определенной цветовой группе белков, может быть использована для изменения или оптимизации оптических свойств ФБ с дальнейшей целью рационального подхода в создании флуоресцентных сенсоров с заданными свойствами для живых систем. В будущем, применение флуоресцентных сенсоров с заданными свойствами, внесет весомый вклад в развитие методик, используемых в медицине для изучения молекулярных механизмов множества заболеваний, включая такие как рак, нарушения связанные с генными дефектами и т.п.
1.Pakhomov A.A. and Martynov V.I. (2008) GFP family: Structural insights into spectral tuning // Chem Biol 15, 755-764.
2.А.А. Пахомов, В.И. Мартынов (2009) Посттрансляционная химия белков семейства GFP // Биохимия 74, 309-319.
Статьи:
3.Martynov V.I., Savitsky A.P, Martynova N.Y, Savitsky P.A, Lukyanov K.A, Lukyanov S.A. (2001) Alternative cyclization in GFP-like proteins family. The formation and structure of the chromophore of a purple chromoprotein from Anemonia sulcata. // J Biol Chem. 276, 21012-21016.
4.Gurskaya N.G, Fradkov A.F, Terskikh A., Matz M.V, Labas Y.A, Martynov V.I., Yanushevich Y.G, Lukyanov K.A, Lukyanov S.A. (2001) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. // FEBS Lett. 507, 16-20.
5.Fradkov A.F, Verkhusha V.V, Staroverov D.B, Bulina M.E, Yanushevich Y.G, Martynov V.I., Lukyanov S., Lukyanov KA. (2002) Far-red fluorescent tag for protein labelling. // Biochem J. 368, 17-21.
6.Martynov V.I., Maksimov B.I, Martynova N.Y, Pakhomov A.A, Gurskaya N.G, Lukyanov S.A. (2003) A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. // J Biol Chem. 278, 46288-46292.
7.А.А. Пахомов, Н.Ю. Мартынова, Н.Г. Гурская, Т.А. Балашова, В.И. Мартынов (2004) Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. // Биохимия 69, 1108-1117.
8.Pakhomov A.A., Pletneva N.V., Martynov V.I. (2005) The molecular basis for the green to red conversion of the fluorescent protein from Dendronephthya sp. // FEBS J. 272, S. 1, p. 384.
9.Yampolsky I.V, Remington S.J, Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2005). Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. // Biochemistry 44, 5788-5793.
10.Pletneva N., Pletnev S., Tikhonova T., Popov V., Martynov V., and Pletnev V., (2006) Structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore, // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 527-532.
11.Pakhomov A.A., Pletneva N.V., Balashova T.A., and Martynov V.I. (2006) Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea // Biochemistry 45, 7256-7264.
12.Н. В. Плетнева, С. В. Плетнев, Д. М. Чудаков, Т. В. Тихонова, В. О. Попов, В. И. Мартынов, А. Влодавер, З. Даутер, В. З. Плетнев (2007) Пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 Å. // Биоорг. химия 33, 390-398.
13.Tretyakova, Y.A., Pakhomov, A.A., and Martynov, V.I. (2007) Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata, // J Amer Chem Soc 129, 7748-7749.
14.Pletneva N, Pletnev V, Tikhonova T, Pakhomov AA, Popov V, Martynov V.I., Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev S (2007) Refined crystal structures of red and green fluorescent proteins from the button polyp Zoanthus , // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 1082-1093.
15.Pakhomov A.A. and Martynov V.I. (2007) Chromophore aspartate oxidation-decarboxylation in the green-to-red conversion of a fluorescent protein from Zoanthus sp. 2, // Biochemistry 46, 11528-11535.
16.Pakhomov A and Martynov V. (2009) Molecular mechanisms of chromophore modifications in fluorescent proteins, // FEBS J. 276, s. 1, 381-382.
17.Pletnev S., Gurskaya N., Pletneva N.V., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Martynov V.I., Popov V.O., Kovalchuk M.V., Wlodawer A., Dauter Z. and Pletnev V. (2009) Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed, // J Biol Chem. 284, 32028-32039.
18.А.А. Пахомов, Ю.А. Третьякова, В.И. Мартынов (2010) Посттрансляционные реакции, приводящие к смещению спектров белка asFP595 из Anemonia sulcata в длинноволновую область, // Биоорг. химия 36, 117-121.
19.Pletneva, N.V., Pletnev, V.Z., Lukyanov, K.A., Gurskaya, N.G., Goryacheva, E.A., Martynov, V.I., Wlodawer, A., Dauter, Z., and Pletnev, S. (2010) Structural evidence for a dehydrated intermediate in green fluorescent protein chromophore biosynthesis, // J Biol Chem. 285, 15978-15984.
20.Pakhomov, A.A. and Martynov V.I. (2011) Probing the structural determinants of yellow fluorescence of a protein from Phialidium sp. // Biochem Biophys Res Commun. 407, 230-235.
21.Пахомов А.А., Мартынов В.И. (2011) Метод определения трехмерной структуры флуоресцентных белков при помощи гомологичного моделирования и масс-спектрометрии. // Биоорг. химия 37, 429-432.
22.Пахомов А.А., Третьякова С.А., Мартынов В.И. (2012) Влияние хромофор – белковых взаимодействий на спектральные свойства желтого флуоресцентного белка // ДАН 445, 594–596.
23.Pletneva, N.V., Pletnev, V.Z., Souslova E., Chudakov D. M., Lukyanov S., Martynov V.I., Arhipova S., Artemyev I., Wlodawer, A., Dauter, Z., and Pletnev, S. (2013) Yellow fluorescent protein phiYFPv (Phialidium): structure and structure-based mutagenesis // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1005-1012.