Научная тема: «БИОСЕНСОРЫ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И ДРУГИХ РЕДОКС-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ: СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ»
Специальность: 03.01.03
Год: 2013
Отрасль науки: Биологические науки
Основные научные положения, сформулированные автором на основании проведенных исследований:
  1. В настоящей работе впервые были созданы генетически кодируемые индикаторы пероксида водорода. Биосенсор HyPer стал первым в мире инструментом, позволившим отслеживать динамику пероксида водорода в живых клетках и тканях. Его специфичность и обратимость делает HyPer незаменимым в исследованиях физиологических и патологических состояний, ассоциированных с продукцией АФК. Преимуществами сенсора HyPer являются также рациометрический сигнал и полностью белковая природа самого сенсора, что позволяет локализовать его в различных внутриклеточных компартментах и предоставляет широкие возможности создания трансгенных животных, экспрессирующих сенсор.
  2. Вслед за HyPer, были получены сенсоры HyPer-2 и HyPer-3, отличающиеся увеличенным, по сравнению с HyPer, динамическим диапазоном. Использование этих сенсоров существенно упрощает детекцию небольших концентраций Н2О2. Был также создан красный флуоресцентный индикатор Н2О2, HyPer-Red.
  3. На примере сенсоров HyPer и HyPer-3 впервые было продемонстрировано, что сенсоры на базе одного флуорофора (пермутированного флуоресцентного белка) способны менять время жизни флуоресценции. Сенсоры были успешно применены для детекции Н2О2 in vivo в режиме детекции времени жизни флуоресценции FLIM.
  4. Белковая природа сенсора HyPer позволила нам создать метод детекции локальных изменений концентрации Н2О2 на уровне суб-компартментов. Сшивая HyPer с белками, локализованными на различных клеточных мембранах, мы впервые продемонстрировали существование микродоменов Н2О2, ассоциированных с активированной рецепторными тирозинкиназами резидентной ретикулярной тирозинфосфатазой PTP-1B. В ходе выполнения данной части работы мы впервые получили прямое доказательство того, что пероксид водорода локализован вблизи мест его производства и его диффузия в цитоплазме существенно ограничена.
  5. Путем комбинирования биосенсора HyPer в одном химерном белке с РН-доменом киназы BTK нам удалось создать сенсор, позволяющий одновременно детектировать Н2О2 (по изменению соотношения пиков возбуждения сенсора HyPer) и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (по транслокации сенсора из цитоплазмы на плазматическую мембрану). С помощью данного сенсора нам впервые удалось наблюдать активность обеих сигнальных систем, липидной и окислительно-восстановительной, в иммунологическом синапсе, образуемом Th-лимфоцитом в процессе активации Т-клеточного рецептора антиген-презентирующими структурами. Мы показали, что не только активность PI3-киназы, но и продукция Н2О2 поляризованы в активируемых Т-клетках.
  6. Биосенсор HyPer позволил нам впервые пронаблюдать за динамикой Н2О2 в фагоцитирующих макрофагах. Мы установили, что пероксид водорода, генерируемый макрофагами, участвует в регуляции МАР-киназ и служит для перепрограммирования фагоцитировавших клеток.
  7. Получен генетически кодируемый флуоресцентный сенсор соотношения НАД+/НАДН, первый сенсор, способный детектировать редокс-состояние данной пары в компартментах, сильно различающихся по количеству НАДН: в цитоплазме и митохондриальном матриксе.
  8. Методическая платформа для детекции АФК и других редокс-активных веществ, созданная в данной работе, применяется в настоящее время сотнями лабораторий в мире, являясь, фактически, безальтернативной в экспериментах, исследующих динамику окислительных процессов. Принципы конструирования биосенсоров, разработанные нами при создании индикаторов семейства HyPer, успешно применяются в других лабораториях при создании биосенсоров. Ведутся работы по созданию на базе биосенсоров Н2О2 систем скрининга лекарственных препаратов, направленных на ингибирование ферментативных систем, генерирующих АФК.
Список опубликованных работ
Обзоры

1.Zorov DB, Bannikova SY, Belousov VV, Vyssokikh MY, Zorova LD, Isaev NK, Krasnikov BF, Plotnikov EY. Reactive oxygen and nitrogen species: friends or foes? Biochemistry (Mosc). 2005 Feb; 70(2): 215-21.

2.Murphy MP, Holmgren A, Larsson N.-G., Halliwell B, Chang C, Kalyanaraman B, Rhee S.-G., Thornalley P, Partridge L, Gems D, Nyström T, Belousov V, Schumacker P, and Winterbourn C. Unravelling the Biological Roles of Reactive Oxygen Species. Cell Metabolism. 2011; 13(4): 361-366.

3.Lukyanov KA, Belousov VV. Biophotonics: The slow fade of cell fluorescence. Nature Photonics. 2012; 6: 641–643

4. Ткачук В.А., Тюрин-Кузьмин П.А., Белоусов В.В., Воротников А.В. Пероксид водорода как новый вторичный посредник. Биологические мембраны. 2012. 29; 1–2: 1-17

Статьи

5.Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 2006 Apr;3(4):281-286.

6.Chudakov DM, Chepurnykh TV, Belousov VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. Traffic. 2006;7(10):1304-1310.

7.Souslova EA, Belousov VV, Lock JG, Strömblad S, Kasparov S, Bolshakov AP, Pinelis VG, Labas YA, Lukyanov S, Mayr LM, Chudakov DM. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC Biotechnology. 2007. 29;7:37.

8.Markvicheva KN, Bogdanova EA, Staroverov DB, Lukyanov S, Belousov VV. Imaging of intracellular hydrogen peroxide production with HyPer upon stimulation of HeLa cells with epidermal growth factor. Methods in Molecular Biology. 2009;476:76-83.

9.Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nature Chemical Biology. 2009;5(7):459-461.

10.Марквичева К.Н., Гороховатский А.Ю., Мишина Н.М., Мудрик Н.Н., Винокуров Л.М., Лукьянов С.А., Белоусов В.В. Сигнальная функция фагоцитарной NADPH-оксидазы: активация МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Биоорганическая химия. 2010; 36: 133-138

11.Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян К.М., Морозов Я.И., Мишина Н.М., Белоусов В.В., Воротников А.В. НАД(Ф)Н оксидаза регулирует EGF-зависимую пролиферацию клеток по механизму, отличному от активации ERK1/2 МАР-киназ. Биофизика. 2010; 55: 1048-1056

12.Malinouski M, Zhou Y, Belousov VV, Hatfield DL, Gladyshev VN. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PLoS One. 2011; 6(1): e14564.

13.Mishina NM, Tyurin-Kuzmin PA, Markvicheva KN, Vorotnikov AV, Tkachuk VA, Laketa V, Schultz C, Lukyanov S, Belousov VV. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxidants & Redox Signaling. 2011; 14(1): 1-7.

14. Markvicheva KN, Bilan DS, Mishina NM, Gorokhovatsky AY, Vinokurov LM, Lukyanov S, Belousov VV. A genetically encoded sensor for Н2О2 with expanded dynamic range. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011; 19(3): 1079-1084.

15.Mishina NM, Bogeski I, Bolotin DA, Hoth M, Niemeyer BA, Schultz C, Zagaynova EV, Lukyanov S, Belousov VV. Can We See PIP(3) and Hydrogen Peroxide with a Single Probe? Antioxidants & Redox Signaling. 2012; 17(3): 505-512.

16.Bilan DS, Pase L, Joosen L, Gorokhovatsky AY, Ermakova YG, Grabher C, Gadella TWJ, Schultz C, Lukyanov S, Belousov VV. HyPer-3: a genetically encoded Н2О2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 2013 Mar 15; 8(3): 535-542