Научная тема: «ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ТРАНСПОРТА МАКРОМОЛЕКУЛ В БАКТЕРИАЛЬНОМ И ВИРУСНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ И СОЗДАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛАТФОРМЫ ПРОДУКЦИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ»
Специальность: 03.01.03
Год: 2013
Отрасль науки: Биологические науки
Основные научные положения, сформулированные автором на основании проведенных исследований:
В результате проделанной работы нами создана модельная система для изучения способности кнРНК и коротких мРНК, индуцируемых стрессовыми воздействиями, подавлять ядерный экспорт хозяйской мРНК и мРНК зеленого флуоресцирующего белка, GFP. Создан набор генетических конструкций для синтеза РНК, направляемых ДНК-зависимой-РНК-полимеразой (Pol) I, II и III в растительной клетке. При ко-агроинфильтрации листьев N.benthamiana генетическими конструкциями, обеспечивающими синтез кнРНК клеточной Pol II, совместно с конструкций, кодирующей GFP, наблюдалось значительное снижение уровня экспрессии последнего, в то время как кнРНК, синтез которых направляется в клетке Pol I или III, не оказывали влияние на экспрессию гена GFP. Степень ингибирования экспрессии гена GFP, а также клеточного гена BiP напрямую зависела от длины некодирующего транскрипта и «силы» промотора. Показано также, что короткие транслируемые транскрипты, или короткие мРНК (кмРНК), также способны конкурировать за ядерный экспорт с другими более длинными мРНК. Гипотеза о том, что кнРНК и кмРНК могут блокировать ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК, участвующих в антивирусной защите клетки, подтверждена экспериментально. Показано, что при доставке в клетки растения плазмид, кодирующих короткие РНК, совместно с векторами, направляющими синтез РНК ВТМ или Х-вируса картофеля (ХВК), наблюдается значительное повышение эффективности репродукции вируса.

Предложены две схемы, «песочные часы» и «генные ворота», отражающие механизмы конкуренции между молекулами кнРНК/кмРНК и мРНК при прохождении ими ядерной поры.

Для исследования роли второго уровня транспорта в растении, движения макромолекул из клетки в клетку, разработана экспериментальная модель регулируемого межклеточного транспорта в листьях табака, когда после воздействия газообразного метанола на интактное растение, плазмодесмы его листьев «открываются». Эта модель позволяет изучать участие межклеточного транспорта в реакции растений на травму, вторжение вируса и бактериальных патогенов. Показано, что механическое повреждение листьев растения приводит к активному синтезу ПМЭ de novo, сопровождаемого повышением уровня образования и выделения в атмосферу метанола. Газообразный метанол или пары, испускаемые поврежденным растением, вызывают у соседних интактных растений устойчивость к бактериальным патогенам, R. solanacearum и A. tumefaciens. Были выявлены гены, индуцируемые метанолом (methanol-inducible genes, МИГ), большинство из которых связано с защитой растения и межклеточным транспортом. Среди них ген β-1,3-глюканазы (BG), ген NCAPP (non-cell-autonomous pathway protein) и ранее не идентифицированный ген, MIG-21. Эксперименты с ВТМ и вектором, кодирующим две тандемные копии GFP и используемым в качестве индикатора межклеточного транспорта, показали, что BG, MIG-21 и NCAPP вызывают увеличение пропускной способности плазмодесм, приводящее к повышению эффективности перемещения вирусной РНК из клетки в клетку. Показано, что газообразный метанол или пары, испускаемые травмированным растением, повышают эффективность репродукции ВТМ в соседних растениях. Был сделан вывод, что метанол, выделяемый поврежденными тканями, индуцирует повышение экспрессии генов межклеточной коммуникации (BG, MIG-21 и NCAPP) в соседних растениях и приводит к более активному транспорту в нем РНК ВТМ. Выявлено участие ПМЭ и метанола в блокаде ядерно-цитоплазматического транспорта. Создана модель, согласно которой бактериальные белки, содержащие сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), конкурируют с ТБ  ВТМ за NCAPP, играющий роль рецептора и переносчика хозяйских и вирусных транспортных белков.

Список опубликованных работ
1.Комарова Т.В., Шеваль Е.В., Поздышев Д.В., Колесникова В.С., Дорохов Ю.Л. Интенсивный синтез зеленого флуоресцирующего белка ведет к формированию Y-тел включения в растительной клетке. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 742-749.

2.Комарова Т.В., Шварц А.М., Макаров А.А., Дорохов Ю.Л. (2012) Новый вирусный вектор, эксплуатирующий транскрипцию РНК-полимеразой I. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 649-656.

3.Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I.V., Frolova O.Y., Pozdyshev D.V. and Gleba Y.Y. Airborne signals from a wounded leaf facilitate viral spreading and induce antibacterial resistance in neighboring plants. // PLoS Pathogens. 2012. V. 8. e1002640.

4.Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Petrunia I.V., Kosorukov V.S., Zinovkin R.A., Shindyapina A.V., Frolova O.Y., and Gleba Y.Y. Methanol may function as a cross-kingdom signal. // PLoS One. 2012. V. 7. e36122.

5.Pozdyshev D.V., Komarova T.V., Petrunia I.V., Dorokhov Y.L. Plant wounding influences on neighboring plant immunity. // FEBS Journal. 2012. V. 279 (Suppl 1). P. 73.

6.Тюлькина Л.Г., Скурат Е.В., Фролова О.В., Комарова Т.В., Каргер Е.М., Атабеков И.Г.. Новый вирусный вектор для суперпродукции эпитопов вакцинных белков в растениях. // ACTA NATURAE. 2011. T. 3. C. 32-42.

7.Petrunia I.V., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Methanol emission by wounded plant enhances mice attraction: behavioral and gene-expression analysis. // FEBS Journal. 2011. V. 278 (Suppl 1). P. 146.

8.Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Skrypnik K.A., Gleba Y.Y., Dorokhov Y.L. Plant-made trastuzumab (herceptin) inhibits her2/neu+ cell proliferation and retards tumor growth. // PLoS One. 2011. V. 6. e17541.

9.Makarov A., Komarova T., Shwartz A., Dorokhov Y. RNA polymerase I directed synthesis and expression of polycistronic viral RNA. // FEBS Journal. 2010. V. 277 (Suppl 1). P. 229.

10.Komarova T.V., Schwartz A.M., Frolova O.Y., Zvereva A.S., Gleba Y.Y., Cytovsky V., Dorokhov Y.L. Pol II-directed short RNAs suppress the nuclear export of mRNA. // Plant Mol Biol. 2010. V. 74. P. 591-603.

11.Frolova O.Y., Petrunia I.V., Komarova T.V., Kosorukov V.S., Sheval E.V., Gleba Y.Y., Dorokhov Y.L. Trastuzumab-binding peptide display by Tobacco mosaic virus. //. Virology. 2010V. 407. P. 7-13.

12.Komarova T.V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E., Dorokhov Y.L. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. // Expert Rev Vaccines. 2010. V. 9. 859-876.

13.Komarova T.V., Sheval E.V., Dorokhov Y.L. Uncontrolled protein overexpression leads to plant cell autophagy. // FEBS Journal. 2009. V. 276 (Suppl 1). P. 206.

14.Petrunia I.V., Frolova O.Y., Komarova T.V., Dorokhov Y.L. Plant as a factory for breast cancer antigen production. // FEBS Journal. 2009. V. 276 (Suppl 1). P. 70.

15.Зверева A.C., Петровская Л.Е., Родина А.В., Иванов П.И., Фролова О.Ю., Шингарова Л.Н., Комарова Т.В., Дорохов Ю.Л., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Атабеков И.Г. Продукция в растениях биологически активных миелоцитокинов человека. // Биохимия. 2009. T. 74. C. 1459-1468.

16.Komarova T.V., Dorokhov Y.L. RNA-polymerase II-derived non-coding RNAs suppress mRNA export and abolish antiviral protection in plants. // FEBS Journal. 2008. V. 275 (Suppl 1). P. 70.

17.Shwartz A.M., Komarova T.V., Skulachev M.V. Destabilization of messenger RNA with long 3´UTR in plants. // FEBS Journal. 2008. V. 275 (Suppl 1). P. 464.

18.Petrunia I.V., Frolova O.Y., Komarova T.V., Kiselev S.L., Citovsky V., and Dorokhov Y.L. Agrobacterium tumefaciens caused bacteraemia does not lead to GFP gene expression in mouse organs. // PLoS One. 2008. V. 3. e2352.

19.Шварц А.М., Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. Стабильность мРНК в растениях зависит от длины 3´-нетранслируемой области. // Биохимия. 2007. T. 72. C. 260 – 269.

20.Dorokhov Yu.L, Frolova O.Yu., Sheveleva A.A, Komarova T.V., Zvereva A.S., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves. // Tuberculosis (Edinb.). 2007. V. 87. P. 218-224.

Монографии и главы в книгах

1.Komarova T.V., Petrunia I.V., Dorokhov Y.L. Vaccine peptide display on recombinant TMV particles. // Plant-derived Vaccines: Technologies & Applications. Future Medicine Ltd. 2011. eBook ISBN: 978-1-78084-092-5

2.Komarova T.V., Citovsky V., Dorokhov Y.L. Pectin methylesterase enhances Tomato bushy stunt virus P19 RNA silencing suppressor effects. // RNAi technology, eds: R.K. Gaur, Y. Gafni, P.Sharma and V.K.Gupta. CRC Press, FL, USA. 2011. P. 125-137.

Патенты и патентные заявки

1.Дорохов Ю.Л., Комарова Т.В., Фролова О.Ю. Антитело против фактора роста эндотелия сосудов и способ продукции антитела в растении. // 2011. Патент РФ № 2412251.

2.Дорохов Ю.Л., Комарова Т.В., Косоруков В.С. Антитело, специфически взаимодействующее с онкобелком HER2/neu. // 2011. Патент РФ №2425840.

3.Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Frolova O.Y., Petrunia I.V., Uryvaev L.V., Alkhovsky S.A., Samokhvalov E.I. Method of producing nucleoprotein nanoparticles. // 2010. WO2010039056

4.Dorokhov Y.L., Komarova T.V. Method for overproducing anti-HER2/Neu oncogene antibodies in plant. // 2009. WO 2009048354.

5.Dorokhov Y.L., Komarova T.V., Atabekov J.G. Method of hyperproduction of target protein in a plant. // 2008. WO2008063093.