Разработан эффективный препаративный метод получения природных и модифицированных OdN, основанный на применении триэфирного метода синтеза в растворе с использованием 5´-фосфатов 2´-дезоксинуклеозидов в качестве исходных соединений. Метод отличается универсальностью, масштабами синтеза и экономичностью. С его помощью получены серии 5´-фосфорилированных природных и модифицированных OdN в препаративных количествах. Эти олигомеры успешно использованы сотрудниками НИБХ СО АН и ИХБФМ СО РАН в качестве инструментов молекулярно-биологических исследований при проведении большого цикла фундаментальных работ по изучению закономерностей комплементарно-адресованной модификации НК, исследованию возможностей антисмыслового подхода к регуляции экспрессии генов и контролированию развития вирусных инфекций в культурах клеток и in vivo. С использованием полученных в настоящей работе фосфотриэфирных этилированных аналогов олигонуклеотидов сотрудниками НИБХ СО АН осуществлен цикл фундаментальных исследований по выявлению зависимости степени поглощения олиготимидилатов клетками от гидрофобности олигомеров (доли фосфотриэфирных фрагментов) и от конфигурации асимметрического фосфотриэфирного центра. Обнаружена зависимость степени комплементарно-адресованной модификации поли(А)-трактов мРНК этиловыми эфирами олиготимидилатов от конфигурации при асимметрических атомах фосфора в культуре клеток.
Применение эффективного препаративного метода получения природных и модифицированных OdN в растворе, разработанного в ходе настоящего исследования, позволило обеспечить модельными соединениями проведение фундаментальных работ по определению пространственной структуры комплементарных комплексов природных OdN, их конъюгатов и аналогов в растворе методом ЯМР в НИБХ СО РАН и Университете штата Техас (США). В настоящее время мы работаем над дизайном и синтезом модельных соединений (конъюгатов моно-, ди- и олигонуклеотидов) для изучения химической поляризации ядер методом ЯМР в МТЦ СО РАН.
В ходе разработки комплекса подходов к синтезу модифицированных по сахарофосфатному остову и по гетероциклическим основаниям OdN получены новые 5´-и/или 3´-конъюгаты OdN с соединениями различной природы: интеркалирующими (хромонами, кумаринами), реакционноспособными (порфиринами, фталоцианинами, урокановой и имидазолуксусной кислотами), гидрофобными (холестерином) остатками. Для синтеза OdN, модифицированных внутри олигонуклеотидной цепи, впервые предложено использовать амидофосфиты, содержащие метоксиоксалилные группы-предшественники, присоединенные к гетероциклическим основаниям или к углеводному остатку. Реализация прекурсорного подхода с помощью этих синтонов открывает перспективы получения олигомеров, модифицированных внутри цепи, методами комбинаторной химии.
В ходе поиска транспортных форм OdN, предназначенных для антисмысловой терапии (про-OdN), предложен новый подход к обратимому блокированию межнуклеотидных фосфатных групп в OdN, заключающийся в применении фотолабильных фосфотриэфирных аналогов OdN. В рамках подхода осуществлен дизайн и разработаны методы синтеза новых фотолабильных триэфирных аналогов олигонуклеотидов в растворе и на полимерном носителе. Найдены условия фотодеблокирования этих соединений.
Для осуществления обратимого модифицирования OdN по концам олигомера или внутри цепи предложены оригинальные универсальные фотолабильные линкерные группы, содержащие о-нитробензильный фрагмент. Дизайн новых линкеров позволяет реализовывать различные стратегии синтеза конъюгатов OdN, гибко варьируя методы получения и место модифицирования в зависимости от целей дальнейшего применения конъюгатов.
Предложен новый эффективный метод синтеза 5´-трифосфатов природных динуклеотидов, основанный на активации 5´-монофосфата динуклеотидов под действием 2,2´-дипиридилдисульфида и трифенилфосфина в присутствии нуклеофильного катализатора. Разработан новый подход к синтезу 5´-трифосфатов модифицированных моно- и динуклеозидов. Подход заключается в комбинации синтеза нуклеозидной части молекулы в растворе с использованием широкого арсенала олигонуклеотидной химии с последующим введением трифосфатного остатка в соответствующим образом защищенные олигомеры и последующей постсинтетической обработке в случае необходимости. Разработанные методы обеспечивают получение природных и модифицированных 5´-трифосфатов моно- и динуклеотидов с высоким выходом и в препаративных количествах.
С использованием новых подходов и методов созданы серии 5´-трифосфатов природных и модифицированных динуклеотидов - потенциальных субстратов для ферментов матрично-зависимого синтеза олигонуклеотидов. Трифосфаты содержат широкий спектр модификаций как в углеводофосфатном остове, так и в гетероциклических основаниях и могут быть полезны при синтезе высокофункционализированных НК или при создании аптамеров. Методы синтеза трифосфатов природных и модифицированных динуклеотидов защищены патентами РФ.
Разработаны дизайн и оригинальная стратегия получения новых оксалилдиамидных миметиков НК с использованием морфолиновых аналогов нуклеозидов. Стратегия основана на разности реакционных способностей аминогрупп мономерных синтонов и заключается в применении бифункциональных реагентов и минимального количества защитных групп. Разработаны новые методы синтеза в растворе и на полимере N-метиленкарбоксамидных морфолиновых миметиков НК - урацил- и аденин-содержащих олигомеров длиной до 12-16 звеньев. Впервые показано, что комплексы N-метиленкарбоксамидных аденин-содержащих олигомеров с поли(U) обладают бóльшей термостабильностью в сравнении с поли(dT).
Предложенные в работе подходы и методы позволяют осуществлять дизайн новых производных OdN и создавать новые инструменты молекулярно-биологических исследований на основе природных и модифицированных OdN.
1.Abramova T.V., Kassakin M.F., Silnikov V.N. Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits – Antisense technologies: new chemical possibilities // Ind. J. Chem. 2009. V. 48B. P. 1721-1726.
2.Абрамова Т.В., Сильников В.Н. Синтез и свойства модифицированных по углеводофосфатному остову аналогов олигонуклеотидов и миметиков нуклеиновых кислот // Успехи химии. 2011. Т.80. С. 452-476.
Статьи в научных журналах
3.Подуст Л.М., Гайдамаков С.А., Абрамова Т.В., Власов В.В., Горн В.В., Фёдорова О.С. Специфичная к последовательности модификация двуцепочечной ДНК олигодезоксирибонуклеотидом рТ(СТ)6 // Биоорг. химия. 1989. Т. 15. № 3. С.363-369.
4.Абрамова Т.В., Комарова Н.И., Мундус Д.А., Перебоева О.С. Эффективный синтез 5’-фосфорилированных дезоксирибоолигонуклеотидов в препаративных количествах // Изв. СО АН СССР. 1990. Сер. хим. наук. Вып. 5. С. 45-51.
5.Mazzei M., Balbi A., Grandi T., Sottofattori E., Garzoglio R., Abramova T., Ivanova E. Synthesis in solution of oligonucleotides and some their 5’- and 3’-linked derivatives // Il Farmaco. 1993. V.48. P. 1649-1661.
6.Покровский А.Г., Плясунова О.А., Блинов В.М., Власов В.В., Свинарчук Ф.П., Абрамова Т.В., Горн В.В., Коневец Д.А. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека смысловыми и антисмысловыми олигонуклеотидами // Мол. биология. 1993. Т. 27. С. 1039-1043.
7.Balbi A., Sottofattori E., Grandi T., Mazzei M., Abramova T.V., Lokhov S.G., Lebedev A.V. Synthesis and complementary complex formation properties of oligonucleotides covalently linked to new stabilizing agents // Tetrahedron. 1994. V.50. P. 4009-4018.
8.Mazzei M., Grandi T., Balbi A., Abramova T., Damonte G., Silvestro L. Protected 5-fluoro-2’-deoxyuridine monophosphate for solution-phase synthesis of oligonucleotides // Il Farmaco. 1994. V. 49. P. 793-797.
9.Абрамова Т.В., Бугреев Д.В., Добриков М.И., Леблё Б., Леонетти Ж.-П. Фотолабильный линкер для обратимого введения лигандов в олигонуклеотиды // Биоорг. химия. 1999. Т. 25. С. 195-202.
10.Abramova T., Ivanova T., Koval V., Fedorova O. Synthesis of new oligonucleotide derivatives with porphyrins and phtalocyanins // Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1515-1516.
11.Абрамова Т.В., Леонетти Ж.-П., Власов В.В., Леблё Б. Синтез и свойства блокированных фотолабильными группами фосфотриэфирных производных динуклеозидфосфатов // Биоорг. химия. 2000. Т. 26. С. 197-205.
12.Карягин А.Ю., Абрамова Т.В., Сильников В.Н., Шишкин Г.В. Реагенты для направленной модификации биополимеров. Сообщение 11. Синтез N-Im-2,4-динитрофенильных производных гистидина, урокановой и имидазолилуксусной кислот для введения остатков имидазола в олигонуклеотиды // Изв. РАН. Сер. хим. 2000. № 3. С. 536-541.
13.Коваль В.В., Черноносов А.А., Абрамова Т.В., Иванова Т.М., Федорова О.С., Кнорре Д.Г. Синтез конъюгата тетракарбоксифталоцианина кобальта (II) с дезоксирибоолигонуклеотидом, реагента для направленной модификации ДНК // Биоорг. химия. 2000. Т. 26. С. 118-125.
14.Koval V.V., Chernonosov A.A., Abramova T.V., Ivanova T.M., Fedorova O.S., Derkacheva V.M., Lukyanets E.A. Photosensitized and catalytic oxidation of DNA by metallophtalocyanine-oligonucleotide conjugates // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 1259-1262.
15.Thiviyanathann V., Vyasovkina K.V., Gozansky E.K., Bichenkova E.V., Abramova T.V., Luxon B.A., Lebedev A.V., Gorenstein D.G. Structure of hybrid backbone methylphosphonate DNA-heteroduplexes: effect of R and S stereochemistry // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 827-838.
16.Абрамова Т.В., Васильева С.В., Иванова Т.М., Шишкин Г.В., Сильников В.Н. Мономеры для олигонуклеотидного синтеза с линкерами, несущими реакционноспособные остатки. I. Синтез производных дезоксинуклеозидов с метоксиоксалиламидными группами, присоединенными к гетероциклическим основаниям // Биоорг. химия. 2004. Т. 30. С. 254-263.
17.Abramova T.V., Bakharev P.A., Vasilyeva S.V., Silnikov V.N. Synthesis of morpholine nucleosides triphosphates // Tetrahedron Lett. 2004. V. 45. P. 4361-4364.
18.Sottofattori E., Anzaldi M., Mazzei M., Miele M., Balbi A., Pyshnyi D.V., Zakharova O.D., Abramova T.V. Synthesis and hybridization properties of the conjugates of oligonucleotides and stabilization agents. Part 3 // Bioorg. Med. Chem. 2005. V. 13. P. 1515-1522.
19.Abramova T.V., Silnikov V.N. A photocleavable linker for oligonucleotides containing combinatorial libraries // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005. V. 24. P. 1333-1343.
20.Васильева С.В., Красноусова Е.Е., Донина А.А., Абрамова Т.В., Жданова Л.Г., Коваленко С.П., Сильников В.Н. Синтез флюоресцентно меченных олигонуклеотидов, несущих метку в 2’-положении модифицированных аденозина и арабиноаденозина // Изв. АН. Сер. хим. 2006. С. 1618-1624.
21.Abramova T.V., Kassakin M.F, Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Silnikov V.N. New oligonucleotide analogues based on morpholine subunits joined by oxalyl diamide tether // Bioorg. Chem. 2007. V. 35. P. 258–275.
22.Abramova T.V., Vasileva S.V., Serpokrylova I.Yu., Kless H., Silnikov V.N. A facile and effective synthesis of dinucleotide 5’-triphosphates // Bioorg. Med. Chem. 2007. V. 15. P. 6549-6555.
23.Abramova T.V., Vasileva S.V., Koroleva L.S., Kasatkina N.S, Silnikov V.N. Design and synthesis of dinucleotide 5’-triphosphates with expanded functionality // Bioorg. Med. Chem. 2008. V. 16. P. 9127–9132.
24.Касакин М.Ф., Абрамова Т.В., Сильников В.Н. Синтез 2’-аминометилморфолиновых аналогов нуклеозидов // Биоорг. химия. 2011. Т. 37. С. 830-835.
Патенты
25. Абрамова Т.В., Васильева С.В., Серпокрылова И.Г., Власов В.В., Сильников В.В. Способ получения солей 5’-трифосфатов дезоксирибо- и рибоолигонуклеотидов. Патент RU 2326888 С1. Офиц. бюлл. фед. службы по интел. собств., патентам и тов. знакам. № 17, 2008, от 20.06.2008.
26. Абрамова Т.В., Васильева С.В., Королева Л.С., Власов В.В., Сильников В.В. Способ получения солей 5’-трифосфатов природных и модифицированных дезоксирибо- и рибоолигонуклеотидов. Патент RU 2348643 С1. Офиц. бюлл. фед. службы по интел. собств., патентам и тов. знакам. № 7, от 10.03.2009.