- В результате проделанной работы созданы новые «минимальные» экспериментальные системы для анализа механизмов элонгации транскриптов в хроматине различными РНК-полимеразами (РНКП2, РНКП3, E. coli РНКП и РНКП бактериофага SP6) с использованием мононуклеосом. Разработанные системы сделали возможным анализ таких важных аспектов механизма транскрипции хроматина in vivo, как: ко-транскрипционное сохранение/восстановление структуры хроматина (все системы), вытеснение/обмен гистонов H2A/H2B, высокий нуклеосомный транскрипционный барьер и вытеснение всех гистонов при интенсивной транскрипции (РНКП2).
- С помощью разработанных систем были открыты два различных молекулярных механизма элонгации транскриптов в хроматине: РНКП2- и РНКП3-типа (табл. 1). Первый механизм характеризуется высоким нуклеосомным барьером для РНКП2, вытеснением/обменом гистонов H2A/H2B, и сохранением позиций нуклеосом при транскрипции. Второй механизм, характерный для РНКП3 отличается внутриматричным переносом октамера гистонов без потери/обмена гистонов H2A/H2B, и относительно низким нуклеосомным барьером.
- В результате работы оба процесса описаны в терминах структур ДНК-белковых комплексов, формирующихся до, во время и после окончания транскрипции. Установлены молекулярные механизмы формирования нуклеосомного барьера для транскрибирующих РНКП2 и РНКП3, и сохранения нуклеосом при транскрипции РНКП2. Определены молекулярные поверхности РНК полимераз и гистонов, а также последовательности и участки нуклеосомной ДНК и гистонов, играющие ключевую роль в этих процессах.
- Выяснено, что белковые факторы (FACT, TFIIS и нуклеолин), меняют высоту нуклеосомного барьера при транскрипции РНКП2 и обеспечивающие сохранение/восстановление структуры хроматина во время/после транскрипции. Механизм действия факторов описан в терминах их влияния на процессивность РНКП2 и на структуры ДНК-белковых комплексов, формирующихся во время и после транскрипции хроматина РНКП2.
- В целом, полученные в работе данные существенно углубляют наши знания о молекулярных механизмах транскрипции хроматина и представляют значительный интерес для понимания основных принципов регуляции экспрессии генов. Кроме фундаментальной значимости, результаты работы имеют важное практическое значение и могут найти применение во многих прикладных исследованиях. Так, экспрессия многих человеческих прото-онкогенов (например, с-myc и c-fos) регулируется на уровне элонгации транскриптов; более того, элонгационные факторы играют важную роль в развитии многочисленных заболеваний человека, включая ВИЧ и лейкемию. Наконец, процесс восстановления хроматина во время элонгации транскриптов имеет важное значение для нормального старения. Открытия, сделанные в работе, могут быть использованы для создания новых типов ингибиторов и стимуляторов транскрипции РНКП2, а также для контроля метаболизма хроматина во время транскрипции.
1.Студитский В.М., Храпко К.Р. Энхансеры, ДНК-петли и стабильные комплексы: механизм активации транскрипции //Молекулярная биология.-1990.- Т.24.- С. 909-919.
2.Studitsky V.M. Allosteric mechanism of enhancer action //FEBS Lett.- 1991.-V280.- P. 5-7.
3.Brodolin K.L., Studitsky V.M., Mirzabekov A.D. Study of the structure of Escherichia coli RNA polymerase and its complex with the lacUV5-promotor using protein-protein and DNA-protein crosslinks, formed by formaldehyde//Mol. Biol.-1993.- V.27.- P.1085-1093.
4.Brodolin K.L., Studitsky V.M., Mirzabekov A.D. Conformational changes in E. coli RNA polymerase during promoter recognition// Nucleic Acids Res.-1993.- V. 21.- P. 5748-5753.
5.Clark D. J., Reitman M., Studitsky V.M., Chang J., Westphal H., Felsenfeld G. Chromatin structure of transcriptionally active genes// In Cold Spr. Harb. Symp. Quiant. Biol.- 1993.-V. 58. - P. 1-6.
6.Studitsky V. M., Clark D.J., Felsenfeld G. A histone octamer can step around a transcribing polymerase without leaving the template// Cell.- 1994.-V. 76.-P.371-382.
7.Studitsky V.M., Clark D.J., Felsenfeld G. Overcoming a nucleosomal barrier to transcription// Cell.-1995.- V.83.- P. 19-27.
8.Studitsky V.M., Clark D.J., Felsenfeld G. Preparation of nucleosomal templates for transcription in vitro// Methods Enzymol.- 1996.- V. 274.- P. 246-256.
9.Felsenfeld G., Boyes J., Chung J., Clark D., Studitsky V. M. Chromatin structure and gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.-1996.- V. 93.- P. 9384-9388.
10.Studitsky V. M., Kassavetis G. A., Geiduschek E. P.,Felsenfel G. Mechanism of transcription through the nucleosome by eukaryotic RNA polymerase// Science.- 1997.-V.278.- P.1960-1963.
11.Studitsky V. M. Preparation and analysis of positioned nucleosomes// Methods Mol. Biol.-1999.- V. 119.- P. 17-26.
12.Bednar J. Studitsky V. M., Grigoryev S. A., Felsenfeld G., Woodcock C. L. The nature of the nucleosomal barrier to transcription: direct observation of paused intermediates by electron cryomicroscopy // Mol. Cell.- 1999.- V. 4.- P. 377-386.
13.Felsenfeld G., Clark D., Studitsky V.M. Transcription through nucleosomes// Biophys. Chem.- 2000.- V. 86.- P. 231-237.
14.Walter W., Studitsky V.M. Facilitated transcription through the nucleosome at high ionic strength occurs via a histone octamer transfer mechanism// J. Biol. Chem.- 2001.- V. 276.- P.- 29104-29110.
15.Studitsky V. M., Brodolin K. L., Liu Y., Mirzabekov A. D. Topography of lacUV5 initiation complexes // Nucleic Acids Res.- 2001.- V. 29.- P. 854-861.
16.Студитский В.М. Транскрипция хроматина// Молекулярная биология.- 2001.- Т. 35.-С. 235-247.
17.Liu Y., Bondarenko V., Ninfa A., Studitsky V.M. DNA supercoiling allows enhancer action over a large distance //Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 2001.- V. 98.- P. 14883-14888.
18.Atkinson M. R., Blauwkamp T.A., Bondarenko V., Studitsky V.M, Ninfa A. J. Activation of the glna, glnk, and nac promoters as Escherichia coli undergoes the transition from nitrogen excess growth to nitrogen starvation// J. Bacteriol.- 2002.- V. 184.- P. 5358-5363.
19.Kireeva M., Walter W., Tchernajenko V., Bondarenko V., Kashlev M., Studitsky V. M. Nucleosome remodeling induced by RNA polymerase II: loss of the H2A/H2B dimer during transcription// Mol. Cell.- 2002.- V.9.- P. 541-552.
20.Bondarenko V. A, Liu Y., Ninfa A.J., Studitsky, V.M. Action of prokaryotic enhancer over a distance does not require continued presence of promoter-bound sigma 54 subunit// Nucleic Acids Res.- 2002.- V. 30.- P. 636-642.
21.Bondarenko V.A., Liu Y.V., Jiang Y.I., Studitsky V.M. Communication over a large distance: enhancers and insulators// Biochem. Cell. Biol.- 2003.- V. 81.- P. 241-251.
22.Bondarenko V.A, Liu Y. V., Ninfa A.J., Studitsky V.M. Assay of prokaryotic enhancer activity over a distance in vitro// Methods Enzymol.- 2003.- V. 370.- P. 324-337.
23.Bondarenko V.A, Jiang Y., Studitsky, V.M. Rationally designed, inducible insulator can block enhancer action in vitro// EMBO J.- 2003.- V. 22. P. 4728-4737.
24.Belotserkovskaya R., Sangtaek O., Bondarenko V.A., Orphanides G., Studitsky V.M., Reinberg D. FACT Facilitates transcription-dependent nucleosome alteration// Science.-2003.- V. 301.- P. 1090-1093.
25.Walter W., Kireeva M., Studitsky V.M. Kashlev, M. Bacterial polymerase and yeast pol II use similar mechanisms for transcription through nucleosomes// J. Biol. Chem.- 2003.- V. 278.- P. 36148-36156.
26.Liu Y., Clark D., Tchernajenko V., Dahmus M. E., Studitsky V. M. Role of CTD phosphorylation in transcription through the nucleosome by polymerase II// Biopolymers.-2003.- V. 68.- P. 528-538.
27.Walter W., Kashlev M., Studitsky V.M. Transcription through the nucleosome by mRNA-producing RNA polymerases// Methods Enzymol.- 2004.- V. 377.- P. 445-460.
28.Studitsky V.M., Walter W., Kireeva M., Kashlev M., Felsenfeld G. Chromatin remodeling by RNA polymerases// Trends Biochem. Sci.- 2004.- V. 29.- P. 127-135.
29.Walter W., Kireeva M.L., Tchernajenko V., Kashlev M., Studitsky, V.M. The fate of the nucleosome during transcription by RNA polymerase II// Methods Enzymol.- 2004.- V. 371.- P. 564-577.
30.Angelov D., Verdel A., An,W., Bondarenko V., Hans F., Doyen C.M., Studitsky V.M., Hamiche A., Roeder R.G., Bouvet P. Dimitrov S. SWI/SNF remodeling and p300-dependent transcription of histone variant H2ABbd nucleosomal arrays// EMBO J.- 2004.-V. 23.- P.- 3815-3824.
31.Walter W., Studitsky V. M. Construction, analysis, and transcription of model nucleosomal templates// Methods.- 2004.- V. 33.- P. 18-24.
32.Студитский, В. М. Ремоделирование хроматина РНК-полимеразой II// Молекулярная биология.- 2005.- Т. 39.- С. 639-654.
33.Kireeva M.L, Hancock B., Komissarova N., Walter W.,. Studitsky V.M. Kashlev M Nature of the nucleosomal barrier to RNA polymerase II// Mol. Cell.- 2005.- V. 18.- P. 97-108.
34.Rubtsov M.A., Polikanov Y.S., Bondarenko V.A., Wang Y.-H. Studitsky V.M. Chromatin structure can greatly facilitate enhancer action over a distance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006.- V. 103.- P. 17690-17695.
35.Bondarenko V.A., Steele L., Ъjvбri A., Gaykalova D., Kulaeva O.I., Polykanov Y., Luse D.S. Studitsky V.M. Nucleosomes can form a polar barrier to transcript elongation by RNA Polymerase II// Mol. Cell.- 2006.- V. 24.- P. 469-479.
36.Angelov D., Bondarenko V.A, Almagro S., Mйnoni H., Mongйlard F., Hans F., Mietton F., Studitsky V.M, Hamiche A., Dimitrov S., Bouvet P. Nucleolin is a histone chaperone with FACT-like activity and assists remodelling of nucleosomes// EMBO J.- 2006.- V. 25.- P. 1669-1679.
37.Doyen C.-M., Woojin A., Angelov D., Bondarenko V., Mietton F., Studitsky V.M, Hamiche A., Roeder R.G., Bouvet P., Dimitrov S. Mechanism of polymerase II transcription repression by the histone variant macroH2A// Mol. Cell. Biol.- 2006.- V. 26.- P. 1156-1164.
38.Polikanov Y.S., Rubtsov M.A. Studitsky V.M. Biochemical analysis of enhancer-promoter communication in chromatin// Methods.- 2007.- V. 41.- P. 250-258.
39.Kulaeva O.I., Gaykalova D.A. Studitsky V.M. Transcription through chromatin by RNA polymerase II: Histone displacement and exchange// Mutat. Res.- 2007.- V.-618.- P. 116-129.
40.Polikanov Y.S., Bondarenko V.A., Tchernaenko V., Jiang Y.I., Lutter L.C., Vologodskii A. Studitsky V.M. Probability of the site juxtaposition determines the rate of protein-mediated DNA looping// Biophys. J.- 2007.- V. 93.- P. 2726-2731.
41.Ujvari A., Hsieh F.K., Luse S.W., Studitsky V.M. Luse, D.S. Histone N-terminal tails interfere with nucleosome traversal by RNA polymerase II// J. Biol. Chem.- 2008.- V. 283.- P. 32236-32243.
42.Morozov A.V., Fortney K., Gaykalova D.A., Studitsky V.M., Widom J., Siggia E.D. Using DNA mechanics to predict in vitro nucleosome positions and formation energies// Nucl. Acids Res.- 2009.- V. 37.- P. 4707-4722.
43.Kulaeva O.I., Gaykalova D., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned nucleosomes // Methods Mol. Biol.- 2009.- V. 523.- P. 109-123.
44.Студитский В.М. Механизмы дистанционной регуляции транскрипции на ДНК и в хроматине// Молекулярная биология.- 2009.- Т. 43.- С. 204-214.
45.Polikanov Y.S., Studitsky V.M. Analysis of distant communication on defined chromatin templates in vitro // Methods Mol. Biol.- 2009.- V. 549.- P. 563-576.
46.Kulaeva O.I., Gaykalova D.A., Pestov N.A., Golovastov V.V., Vassylyev D.G., Artsimovitch I. Studitsky V.M. Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II// Nat. Struct. Mol. Biol.- 2009.-V. 16.- P. 1272-1278.
47.Kulaeva O.I., Hsieh F.K. Studitsky V.M. RNA polymerase complexes cooperate to relieve the nucleosomal barrier and evict histones// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2010.- V. 107.-P. 11325-11330.
48.Hsieh F.K., Fisher M., Ъjvбri A., Studitsky V.M. Luse D.S. Histone Sin mutations promote nucleosome traversal and histone displacement by RNA polymerase II// EMBO Rep.-2010.- V. 11.- P. 705-710.
49.Kulaeva O.I. Studitsky V.M. Mechanism of histone survival during transcription by RNA polymerase II// Transcription.- 2010.- V. 1.- P. 85-88.
50.Gaykalova D.A., Vivekananthan N., Bondarenko V.A., Bartholomew B., Clark D.J. Studitsky V.M. A polar barrier to transcription is circumvented by remodeller-induced nucleosome translocation// Nucl. Acids Res.- 2011.- V. 39.-P. 3520-3528.
51.Luse D.S. Studitsky V.M. The mechanism of nucleosome traversal by RNA polymerase II: roles for template uncoiling and transcript elongation factors// RNA Biol.- 2011.- V. 8.-P. 825-830.
Монографии и главы в книгах
52.Studitsky V.M., Clark, D.J., Felsenfeld G. Mechanism of nucleosome displacement by a transcribing polymerase// In Structural Biology: the state of art / Ed. R.H. Sarma. Adenine Press.- 1994.- P. 125-131.