- В структуре белка человека протимозина альфа идентифицирован сигнал ядерной локализации. Одной из выявленных ядерных функций протимозина альфа является участие в защите клеток от окислительного стресса.
- Обнаружено, что в процессе апоптоза в клетках человека происходит фрагментация протимозина альфа каспазой. В результате гидролиза протимозин альфа теряет сигнал ядерной локализации и меняет свою внутриклеточную локализацию с ядерной на цитоплазматическую.
- Биоинформатический поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина каспазой, выявил белок VirD2 агробактерии Agrobacterium tumefaciens (патогена растений) в качестве потенциальной мишени каспаз. Экспериментально установлено, что белок VirD2 фрагментируется каспазой-3 человека и идентифицированы места гидролиза.
- Используя принцип изменения внутриклеточной локализации белка вследствие фрагментации каспазой, выявленный на примере протимозина альфа, мы обнаружили активацию фитаспазы при индукции ПКС в листьях табака. Показано, что фитаспаза гидролизует белок VirD2 после остатка D в том же месте, что и каспаза-3 человека. Фитаспаза выявлена у широкого круга растительных организмов.
- Разработана процедура выделения фитаспазы из растительных экстрактов. Фитаспазы табака и риса получены в индивидуальном состоянии. Определена субстратная специфичность фитаспаз, показавшая, что эти растительные ферменты, как и каспазы, гидролизуют субстраты строго после остатка D в благоприятном аминокислотном контексте.
- Установлена роль фитаспазы в осуществлении ПКС, вызванной как биотическим (вирусная инфекция), так и абиотическими стрессами (окислительный и осмотический стресс).
- Фитаспазы табака и риса идентифицированы как субтилизин-подобные (сериновые) протеазы растений.
- Активация фитаспазы происходит путем автокаталитического процессинга профермента в соответствии со специфичностью фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования активной фитаспазы и для ее секреции.
- В здоровых листьях растений фитаспаза накапливается в межклеточной жидкости (апопласте), куда направляется N-концевым сигнальным пептидом профермента. Индукция ПКС сопровождается перемещением фитаспазы из апопласта внутрь умирающей клетки.
- Фрагментация агробактериального белка VirD2 фитаспазой является защитным механизмом, препятствующим доставке чужеродной ДНК в ядро растительной клетки.
- Таким образом, у растений идентифицирован и охарактеризован новый тип протеаз, являющихся функциональными аналогами каспаз животных, и выявлены свойства апоптотических протеаз, специфичные для растений.
2.Tuzhikov AI, Vartapetian BB, Vartapetian AB, Chichkova NV (2011) Abiotic stress-induced programmed cell death in plants: a phytaspase connection. In: Abiotic Stress Response in Plants – Physiological, Biochemical and Genetic Perspectives. (Shanker A. and Venkateswarlu B., eds.), ISBN: 978-953-307-672-0, InTech, Chapt. 7, pp. 183-196.
3.Chichkova N.V., Shaw J., Galiullina R.A., Drury G.E., Tuzhikov A.I., Kim S.H., Kalkum M., Hong T.B., Gorshkova E.N., Torrance L., Vartapetian A.B., Taliansky M. (2010) Phytaspase, a relocalisable cell death promoting plant protease with caspase specificity. EMBO J. 29, 1149-1161.
4. Chichkova N.V., Galiullina R.A., Taliansky M.E., Vartapetian A.B. (2008) Tissue disruption activates a plant caspase-like protease with TATD cleavage specificity. Plant Stress 2, 89-95.
5.Reavy B., Bagirova S., Chichkova N.V., Fedoseeva S.V., Kim S.H., Vartapetian A.B., and Taliansky M.E. (2007) Caspase-resistant VirD2 protein provides enhanced gene delivery and expression in plants. Plant Cell Rep. 26, 1215-1219.
6.Reavy B., Taliansky M., Kim S.H., Vartapetian A.B., Chichkova N.V., Bagirova S. (2007) Modified VirD2 protein and its use in improved gene transfer. WO/2007/132193.
7.Евстафьева А.Г., Карапетян Р.Н., Рубцов Ю.П., Филонов Г.С., Абаева И.С., Фатеева Т.В., Мельников С.В., Чичкова Н.В., Вартапетян А.Б. (2005) Новые функции известного белка: участие протимозина альфа в защите клеток от апоптоза и окислительного стресса. Молек. Биология 39, 729-745.
8. Karapetian RN, Evstafieva A.G., Abaeva I.S., Chichkova N.V., Filonov G.S., Rubtsov Y.P., Sukhacheva E.A., Melnikov S.V., Schneider U., Wanker E.E., and Vartapetian A.B. (2005) Nuclear oncoprotein prothymosin α is a partner of Keapl: Implications for expression of oxidative stress-protecting genes. Mol. Cell. Biol. 25, 1089-1099.
9. Chichkova N.V., Kim S.H., Titova E.S., Kalkum M., Morozov V.S., Rubtsov Y.P., Kalinina N.O., Taliansky M.E., and Vartapetian A.B. (2004) A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. Plant Cell 16, 157-171.
10. Evstafieva A.G., Belov G.A., Rubtsov Y.P., Kalkum M., Joseph В., Chichkova N.V., Sukhacheva E.A., Bogdanov A.A., Pettersson R.F., Agol V.I., and Vartapetian A.B. (2003) Apoptosis-related fragmentation, translocation, and properties of human prothymosin alpha. Exp. Cell Res. 284, 209-221.
11. Chichkova, N.V., Evstafieva, A.G., Lyakhov, I.G, Tsvetkov, A.S., Smirnova, T.A., Karapetian, R.N., Karger, E.M., and Vartapetian, A.B. (2000) Divalent metal cation binding properties of human prothymosin a. Eur. J. Biochem. 267, 4745-4752.
12. Shakulov V.R, Vorobjev LA., Rubtsov Y.P., Chichkova N.V., and Vartapetian A.B. (2000) Interaction of yeast importin a with the NLS of prothymosin a is insufficient to trigger nuclear uptake of cargos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 548-552.
13. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.I., and Vartapetian A.B. (2000) Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. FEBS Lett. 467, 150-154.
14. Lukashev D.E., Chichkova N.V., and Vartapetian A.B. (1999) Multiple tRNA attachment sites in prothymosin a. FEBS Lett. 451, 118-124.
15. Vartapetian A., Lukashev D., Lyakhov I., Belyaeva A., Chichkova N., and Bogdanov A. (1997) Mammalian prothymosin alpha links to tRNA in Escherwhia coli cells. RNA 3, 1173-1181.
16. Rubtsov Y.P., Zolotukhin A.S., Vorobjev LA., Chichkova N.V., Pavlov N.A., Karger E.M., Evstafieva A.G., Felber B.K., and Vartapetian A.B. (1997) Mutational analysis of human prothymosin alpha reveals a bipartite nuclear localization signal. FEBS Lett. 413, 135-141.
17. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartapetian A.B., Vasilenko A.V., Abramov V.M., and Bogdanov A.A. (1995) Overproduction in Escherwhia coli, purification and properties of human prothymosin alpha. Eur. J. Biochem. 231, 639-643.