Научная тема: «РОЛЬ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ФОРМИРОВАНИИ ВИРИОНОВ»
Специальность: 03.01.03; 03.02.02
Год: 2013
Отрасль науки: Биологические науки
Основные научные положения, сформулированные автором на основании проведенных исследований:
  • Современное представление о патогенезе вируса гриппа и других оболочечных вирусов, среди которых описано много опасных патогенов человека и животных, предполагает понимание молекулярных перестроек белков вириона при проникновении вируса в клетку и морфогенезе дочерних вирионов. Однако экспериментальных исследований для понимания роли каждого компонента вириона в жизненном цикле вируса и его взаимодействия с системой везикулярного транспорта в клетке недостаточно. Это определяет актуальность исследования особенностей структуры поверхностных белков оболочечных вирусов, в частности, гидрофобных сегментов белков, встроенных в липидную мембрану. Кроме того, в связи с высокой изменчивостью вируса гриппа, риском новых пандемий и крайне скромным арсеналом средств борьбы с ним в эпидемических условиях, существует острая необходимость планирования и разработки новых антивирусных стратегий. В связи с этим выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия хозяина и патогена, представляется актуальным.
  • Протеолиз целых вирионов был впервые предложен в качестве подхода для изучения структурной организации области «ножки» шипа, включающей гомотример линкерных участков. Обнаружено, что локализация сайтов гидролиза ферментами разных классов определяется, главным образом, стерической доступностью зоны расщепления для молекулы фермента, а не собственно специфичностью фермента. В перспективе не исключена возможность прицельного разрушения поверхностных гликопротеинов специально подобранными ферментами с целью ограничить распространение вирусной инфекции.
  • Гидролиз протеазами поверхностных белков, выделенных из интактных вирионов неионным детергентом, непосредственно в мицелле, был предложен как способ экспериментального анализа упаковки трансмембранных доменов белков в составе природных олигомеров. Обнаруженные различия в гомотримерной упаковке трансмембранных доменов у гемагглютининов разных эволюционных групп вируса гриппа А, подтвержденные данными компьютерного моделирования, проясняют, почему невозможно формирование «смешанных» тримеров НА подтипов Н1 и Н3, Н1 и Н7 (Sklyanskaya e al., 1988).
  • S-ацилирование вплоть до недавнего времени детектировали на основании метаболического мечения вирусов [3H]-пальмитатом и выяснения, в какой белок включается метка. Последующий хроматографический анализ пула связанных жирных кислот (Veit, 1991) не давал точной информации ни о полноте S-ацилирования белка, ни о типах реально присоединенных к белку остатков жирных кислот, ни об их распределении по потенциальным сайтам. Показано, что в клетке могут происходить метаболические трансформации меченого пальмитата в другой тип жирной кислоты еще до присоединения к белку (Schmidt, 1984). Мы предложили экстрагировать ацилированные пептиды в органическую фазу (сходно с методом экстракции липидов) из обработанных протеазами вирионов. Успешное применение масс-спектрометрического (МС) анализа для детекции гидрофобных пептидов привело к созданию уникального протокола, который до сих пор не имеет аналогов в мире.
  • Впервые показано, что в составе вирионов молекулы НА ацилированы стехиометрически: все потенциальные сайты модифицированы остатками жирных кислот. Далее, обнаружено дифференциальное S-ацилирование остатками пальмитата (С16:0), либо стеарата (С 18:0) в зависимости от локализации сайта ацилирования относительно границы липидного бислоя: только остаток цистеина, расположенный на границе ТМ- и СТ-доменов, может связать стеарат, в то время как остатки цистеина в СТ-домене ацилированы исключительно пальмитатами.
  • Выдвинутая гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе ТМ- и СТ-доменов, оказалась верной в случае гемагглютининов всех типов вируса гриппа, а также всех исследованных представителей «сливающих» белков других семейств оболочечных вирусов. Принципиально разный характер ацилирования, который был обнаружен у НА вирусов гриппа А, В и гомологичного белка гемагглютинин-эстеразы (HEF) вируса гриппа С может быть использован для типирования новых штаммов вируса гриппа.
  • Впервые предпринята попытка оценить биологическую роль S-стеарилирования в экспериментальной модели, использующей серию лабораторных реассортантных клонов, включающих NA и/или НА одного штамма, а внутренние белки - другого. Показано, что ни нейраминидаза, ни белки М1/М2 не влияют на гетерогенность S-ацилирования гомотримера НА в процессе созревания вирионов.
  • Впервые исследованы свойства пептида из 47 аминокислотных остатков, соответствующего С-концевой области штамма A/FPV/Rostock/34 (H7N1), синтезированного в бесклеточной системе (Khabibullina et al., 2010, Mineev et al., 2011) и модифицированного гексадекановыми (С 16:0) алифатическими цепями с целью имитировать пальмитилирование.
Список опубликованных работ
Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1Mineev K.S., Lyukmanova E.N., Krabben L., Serebryakova M.V., Shulepko M.A., Arseniev A.S., Kordyukova L.V., Veit M. Structural investigation of Influenza virus hemagglutinin membrane-anchoring peptide // Protein Engineering, Design, and Selection. 2013. V. 26. P. 547-552.

2Veit M., Serebryakova M.V., Kordyukova L.V. Palmitoylation of influenza virus proteins // Biochemical Society Transactions. 2013. V. 41. P. 50-55.

3Serebryakova M.V., Kordyukova L.V., Rudneva I.A., Kropotkina E.A., Veit M., Baratova L.A. Mass spectrometry analysis of influenza virus reassortant clones does not reveal an influence of other viral proteins on S-acylation of hemagglutinin // Archives of Virology. 2013. V. 158. P. 467-472.

4Кордюкова Л.В., Серебрякова Л.В. Масс-спектрометрические подходы в изучении оболочечных вирусов: новые возможности для структурной биологии и профилактической медицины // Биохимия. 2012. Т. 77. № 8. С. 1002-1016.

5Serebryakova M.V., Kordyukova L.V., Semashko T.A., Ksenofontov A.L., Rudneva I.A., Kropotkina E.A., Filippova I.Y., Veit M., Baratova L.A. Influenza virus hemagglutinin spike neck architectures and interaction with model enzymes evaluated by MALDI-TOF mass spectrometry and bioinformatics tools // Virus Research. 2011. V. 160. P. 294-304.

6Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Polyansky A.A., Kropotkina E.A., Alexeevski A.V., Veit M., Efremov R.G., Filippova I.Y., Baratova L.A. Linker and/or transmembrane regions of influenza A/Group-1, A/Group-2, and type B virus hemagglutinins are packed differently within trimers // Biochimica et Biophysica Acta. 201. V. 1808. P. 1843-1854.

7Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Baratova L.A., Veit M. Site-specific attachment of palmitate or stearate to cytoplasmic versus transmembrane cysteines is a common feature of viral spike proteins // Virology. 2010. V. 398. P. 49-56.

8Shishkov A.V., Bogacheva E.N., Dolgov A.A., Chulichkov A.L., Knyazev D.G., Fedorova N.V., Ksenofontov A.L., Kordyukova L.V., Lukashina E.V., Mirsky V.M., Baratova L.A. The in situ structural characterization of the influenza A virus matrix M1 protein within a virion // Protein and Peptide Letters. 2009. V. 16. P. 1407-1413.

9Smirnova Y.A., Fedorova N.V., Ksenofontov A.L., Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Baratova L.A., Vaskovsky B.V. Isolation of the influenza A HA2 C-terminal segment by combination of nonionic detergents // Advances in Experimental Medicine and Biology. 2009. V. 611. P. 311-312.

10Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Polyakov V.Y., Ovchinnikova T.V., Smirnova Y.A., Fedorova N.V., Baratova L.A. Influenza A virus M1 protein structure probed by in situ limited proteolysis with bromelain // Protein and Peptide Letters. 2008. V. 15. P. 922-930.

11Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Baratova L.A., Veit M. S acylation of the hemagglutinin of influenza viruses: mass spectrometry reveals site-specific attachment of stearic acid to a transmembrane cysteine // Journal of Virology. 2008. V. 82. P. 9288-9292.

12Смирнова Ю.А., Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н, Баратова Л.А. Вирион вируса гриппа как субстрат протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 409-415.

13Ксенофонтов А.Л., Бадун Г.А., Федорова Н.В., Кордюкова Л.В. Количественное определение площади гликобелков на поверхности оболочечных вирусов // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 6. С. 1093-1096.

14Serebryakova M.V., Kordyukova L.V., Baratova L.A., Markushin S.G. Mass spectrometric sequencing and acylation character analysis of C-terminal anchoring segment from Influenza A hemagglutinin // European Journal of Mass Spectrometry. 2006. V. 12. P. 51-62.

15Ксенофонтов А.Л., Козловский В.С., Кордюкова Л.В., Радюхин М, Тимофеева А.В., Добров Е.Н. Определение концентрации и размера агрегатов в препаратах вируса гриппа по спектрам истинного поглощения в УФ-свете. // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. № 1. С. 172-179.

16Kordyukova L.V., Ksenofontov A.L., Serebryakova M.V., Ovchinnikova T.V., Fedorova N.V., Ivanova V.T., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin C-terminal anchoring peptide: identification and mass spectrometric study // Protein and Peptide Letters. 2004. V. 11. P. 385-391.

17Иванова В.Т., Кордюкова Л.В., Маныкин А.А., Бурцева Е.И., Загорская Ю.В., Оскерко Т.А., Слепушкин А.Н.. Особенности протеолитической обработки современных вирусов гриппа А и В. Получение субвирусных частиц с использованием фермента бромелаина // Вопросы вирусологии. 2003. Т. 48. № 5. С. 14-18.

Материалы конференций:

18Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Kropotkina E.A., Veit M. Lipidation of viral proteins studied with MALDI-TOF MS // Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) Science Research Conference «Protein Lipidation, Signaling, and Membrane Domains». Saxtons River (VT, USA). 2013. P2.

19Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Кропоткина Е.А., Veit M., Полянский А.А. Изучение пост-трансляционной модификации (S-ацилирования) вирусных белков методом МАЛДИ-МС // Тезисы III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине (Postgenome 2012)». Казань (Россия). 2012. С. 146-147.

20Serebryakova M.V., Rudneva I.A., Kropotkina E.A., Veit M., Kordyukova L.V. MALDI-TOF MS: a new approach to study S-acylation of viral proteins // Abstracts of A Biochemical Society Focused Meeting «Regulation of protein trafficking and function by palmitoylation». Oxford (UK). 2012. P. 14. P011.

21Brett K., Kordyukova L., Moeller L., Laue M., Veit M. Mutations in the cytoplasmic tail of HA in Influenza virus – with focus on S-Acylation // 3rd International Influenza Meeting. Muenster (Germany). 2012. P. 155. P110.

22Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Полянский А.А., Veit M. Структурные исследования трансмембранных гликопротеинов оболочечных вирусов с использованием методов протеолиза, MALDI-TOF масс-спектрометрии и молекулярного моделирования // Тезисы V Российского симпозиума «Белки и пептиды». Петрозаводск (Россия). 2011. С. 86.

23Kordyukova L.V. Phylogeny of influenza hemagglutinin transmembrane domains: evaluation with enzyme proteolysis, mass spectrometry and bioinformatics tools // Young Scientist Workshop «Methods to study influenza virus». Berlin (Germany). 2011. P. 27-28.

24Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Veit M. Differential S-acylation with palmitate or stearate is a common feature of viral glycoproteins // Abstracts of the 19 Annual Meeting of the Society of Virology (GfV). Liepzig (Germany). 2009. P. 628. VMIT P8.

25Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Veit M., Смирнова Ю.А., Кропоткина Е.А., Баратова Л.А. Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для изучения ацилирования гемагглютинина вируса гриппа // Тезисы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск (Россия). 2008. C. 459.

26Kordyukova L., Serebryakova M., Smirnova Yu., Veit M. Acylation of Influenza Virus Hemagglutinin analyzed by MALDI-TOF MS // Abstract of the 3rd European Virology Congress. Nuremberg (Germany). 2007. P. 47. SAS008.

27Smirnova Ju.A., Kordyukova L.V., Fedorova N.V., Baratova L.A., Serebryakova M.V., Veit М. Influenza virus membrane proteome structural investigation based on enzyme proteolysis and MALDI-TOF mass spectrometry // Proceedings of the 3rd Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB’07). Moscow (Russia). 2007. P. 277-278.

28Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Smirnova Y.A., Ovchinnikova T.V., Lysogorskaya E.N., Filippova I.Y., Baratova L.A. Influenza A virus particles as a substrate for bromelain // Journal of Peptide Science. 2006. V. 12 (S1). P. 168. Th255.

29Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Smirnova Y.A., Fedorova N.V., Timofeeva A.V., Ivanova V.T., Markushin S.G., Baratova L.A. Influenza virus membrane proteins: studying by proteomic tools // Abstracts of the 9th Chinese International Peptide Symposium. 2006. Shanghai (China). P. 45-46.

30Kordyukova L.V., Serebryakova M.V., Ovchinnikova T.V., Ivanova V.T., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin C-terminal anchoring peptide. MS identification and approach to structural study // Peptides-2004. Proceedings of the 3rd International and 28th European Peptide Symposium, eds.: M. Flegel, M. Fridkin, C. Gilon and J. Slaninova. Kenes International, Tel-Aviv, Israel. 2005. P. 435-436.

31Kordyukova L.V., Ksenofontov A.L., Serebryakova M.V., Ovchinnikova T.V., Fedorova N.V., Ivanova V.T., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin C-terminal anchoring peptide. MS identification and approach to structural study // Journal of Peptide Science. 2004. V. 10 (8). P. 165. P174.

32Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В., Овчинникова Т.В., Радюхин В.А. Протеомные исследования заякоренного в мембране С-концевого участка гемагглютинина вируса гриппа // Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва. 2004. С. 46-47.

33Кордюкова Л.В., Ксенофонтов А.Л., Федорова Н.В., Серебрякова М.В., Овчинникова Т.В., Баратова Л.А. Выделение и структурные исследования С-концевого фрагмента гемагглютинина вируса гриппа А // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Москва (Россия). 2003. C. 28.

34Kordyukova L.V., Ksenofontov A.L., Fedorova N.V., Baratova L.A. Influenza A hemagglutinin C-terminal peptide: An attempt for isolation and characterization // 3rd International Symposium on Separations in BioSciencies SBS’03 «100 Years of Chromatography». Moscow (Russia). 2003. P. 135.